BioH的理性设计及不对称水解3-环己烯-1-甲酸甲酯工艺优化

发布时间：2020-07-26 19:50

【摘要】：随着手性药物的市场需求急剧增长,手性药物及其中间体的制备越来越受到人们的关注。S-3-环己烯-1-甲酸是抗凝血药依度沙班的手性前体物质,因此制备光学纯的S-3-环己烯-1-甲酸具有重要意义。目前其生产方式为化学法手性拆分,但存在操作步骤繁琐且过程中要用到有毒的丙酮试剂等缺点。如能开发可代替化学法的简单高效且绿色环保的生物催化途径,将有助于抗凝血药依度沙班的可持续生产。酯酶BioH是一种能够催化酯键水解的酶,可以不对称水解外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯,得到3-环己烯-1-甲酸。但是野生型酯酶BioH对S-3-环己烯-1-甲酸甲酯的选择性不高(ee_p=32.32%),造成目标产物的合成效率和光学纯度均不理想,因此本论文以S-3-环己烯-1-甲酸的生物催化法制备为目标,通过对酯酶BioH进行分子改造来提高其S-选择性。本文利用计算模拟作为辅助工具,通过分子对接的手段,结合酶蛋白-底物的对接构象对酯酶BioH进行了理性设计,通过调整活性口袋的空间位阻作用、酶和底物间的芳香环作用以及氢键作用来调整其对映体选择性,并在此基础上对最终获得的阳性突变体和野生型酯酶BioH进行了分子动力学模拟,对选择性提高的机理进行了探讨。本文具体的研究内容和实验结果如下:(1)基于对酯酶BioH的结构与催化机理的充分了解,把酯酶BioH与底物进行分子对接,根据两种构型的对映异构体底物与酶对接构象的差异,制定理性设计的策略,构建了9个单点突变,其中有6个为对S-3-环己烯-1-甲酸甲酯选择性提高的阳性突变体,进一步通过组合突变获得最优突变体Mu3(L24A/W81A/L209A),其ee_p值达到了70.92%。(2)可溶性表达分析发现,上述突变体均有包涵体表达的情况,特别是Mu3只有微量的可溶性表达,无法达到反应所需的酶浓度。因此,对突变体的诱导表达条件进行了优化,发现IPTG浓度为0.1 mM、16℃、TB培养基诱导24 h时,可溶性表达效果最佳。(3)为了提高Mu3对底物的催化效率,分别考察了温度、pH、助溶剂种类和浓度对催化反应的影响,最终确定最适温度为30oC、最佳pH为8.0,最适助溶剂为2.5%(v/v)的吐温80,反应条件优化后,Mu3的催化活性达到未优化前的2倍左右。(4)通过对野生型酯酶BioH和优势突变体Mu3进行分子动力学模拟分析,分别从结合能和构象的角度分析了Mu3选择性提高的原因。发现Mu3对R-底物和S-底物的结合能差异高于WT(野生型BioH),因此Mu3对S-底物的选择性提高。但是Mu3对R-底物和S-底物的结合能均高于WT,并且突变后过大的活性口袋不利于底物的结合,因此,Mu3酶活低于WT。
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914
【图文】：

构体（Diastereoisomers）。非对映异构体和对映异构体不同，非对映异构体的化学性质虽然相似，但在物理性质上会呈现出一定的差异。图1-1 手性[1]Figure 1-1. Chirality

浙江工业大学硕士学位论文6图1-2 酯酶BioH的催化机理Figure 1-2. Catalytic mechanism of esterase BioH1.3 3-环己烯-1-甲酸1.3.1 S-3-环己烯-1-甲酸的简介S-3-环己烯-1-甲酸是凝血因子 Xa 抑制剂依度沙班（edoxaban，商品名：Savaysa）的重要起始原料。依度沙班是日本第一三共株式会社研发的小分子口服抗凝药，其相对分子质量为 738.27，化学结构式见图 1-3[29]。2014 年，加拿大心房颤动管理指南推荐 Edoxaban 用于非瓣膜性心房颤动患者的抗凝治疗[30]。与用于预防心房颤动患者中风和全身性血栓形成的一线抗凝药物华法林（Warfarin）相比，依度沙班的治疗效果与之相当，但总出血事件和心血管死亡的发生率较低，它未来的应用前景会很好。与同类型凝血因子 Xa 抑制剂药物，如阿哌沙班、利伐沙班比较（表 1-1）[31]

睦硇陨杓萍安欢猿扑釘?3-环己烯-1-甲酸甲酯工艺优化7图1-3 依度沙班的化学结构式[29]Figure 1-1. Chemical structure of Edoxaban表1-1 抗凝血药的药理学参数[31]Table 1-1. Pharmacological characteristics of anticoagulants信息 利伐沙班 阿哌沙班 依度沙班上市时间及地点 2009 年中国 2013 年中国 2011 年日本手性碳原子 有 无 有作用靶点 凝血因子 Xa 凝血因子 Xa 凝血因子 Xa给药方式 口服 口服 口服T1/2（h） 10-14 9-12 6-11生物利用度 50-55 60-86 67代谢途径 66.6%肾脏 25.0%肾脏 35.0%肾脏禁忌 避免与 P-pg 和CYP3A4 的抑制剂联用避免与 P-pg 和CYP3A4 的抑制剂联用未发现1.3.2 S-3-环己烯-1-甲酸的制备目前，通过使用非对映异构体拆分方法可以有效得到 S-3-环己烯-1-甲酸[32]，如图 1-4。以手性苯乙胺作为手性拆分剂，得到外消旋 3-环己烯-1-甲酸与苯乙胺形成的非对映体异构体，基于这对非对映体异构体在丙酮中溶解度的差异来进行分离。缓慢冷却重结晶 6 次后，最终 R-3-环己烯-1-甲酸的得率为 28.3%，S-3-环己烯-1-甲酸的得率为 28.7%，两者的光学纯度均大于 99%

【参考文献】

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1 张华;;新型口服抗凝药物依度沙班[J];中国新药杂志;2015年24期

2 刘韩;吴丽云;高贺;倪辉;蔡慧农;朱艳冰;;易错PCR法提高土芽孢杆菌ZH1羧酸酯酶的热稳定性[J];微生物学报;2015年08期

3 吴秀兰;江金凤;覃丽娟;王慧;;浅谈手性药物拆分技术研究进展[J];海峡药学;2014年07期

4 谭中标;李剑芳;邬敏辰;殷欣;胡蝶;董运海;;脂肪酶热稳定性改造研究进展[J];食品与生物技术学报;2014年07期

5 徐红娜;于洪巍;;羧酸酯酶BioH的克隆表达及其水解活性的定向进化[J];浙江大学学报(农业与生命科学版);2013年06期

6 徐春秀;石玉;张师愚;刘日;夏超;魏会强;李yN亮;;3-环己烯-1-甲酸的手性拆分研究[J];现代药物与临床;2013年02期

7 熊小龙;杜鹏飞;金鹏;王秋岩;谢恬;;脂肪酶催化药物合成的研究进展[J];化学与生物工程;2010年08期

8 赵艳;姚金水;戴罡;呼建强;;以氨基酸为手性源制备手性固定相的研究进展[J];山东轻工业学院学报(自然科学版);2008年04期

9 危凤,杨亦文,任其龙,吴平东;纤维素三苯基氨基甲酸酯涂敷型固定相的制备及其对奥美拉唑的拆分[J];分析化学;2003年06期

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3 叶菲;伯克霍尔德菌脂肪酶LipA盖子结构置换对其底物特异性的影响[D];福建师范大学;2016年

4 尹新昊;依度沙班及其有关物质的合成[D];北京化工大学;2015年

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本文编号：2771210