COPD患者及健康志愿者尿液中筛选出的二甲基砜的药效学及机制研究

发布时间：2020-07-27 08:13

【摘要】：慢性阻塞性肺病(COPD),简称慢阻肺。全球40岁以上人群的发病率达到9%-10%,我国的发病率约为8.2%。慢阻肺的主要表现特征是不完全可逆性的气流受限,而该疾病的严重程度常常同时伴随着异常的炎症反应。老年人因其机体功能下降及免疫功能下降,COPD的发病率较年轻人更高。临床上针对COPD患者的炎症症状,常使用糖皮质激素类药物,但其亦发生骨质疏松、抗免疫功能等不良反应。因此对于寻找能减轻COPD患者伴随的免疫力低下并能提高或者调节平衡COPD患者的免疫功能的潜在药物具有重要的临床意义。本文通过筛选COPD患者与健康志愿者尿液中具有预防、治疗COPD患者的潜在药物,并对其进行抗炎作用的药理药效学研究并探索其对免疫功能的影响及其机制。本文主要通过以下四个章节实验进行研究:第一章:从COPD患者及健康志愿者尿液中筛选差异性表达代谢性小分子,再从中发现具有调节免疫力、防治COPD患者的潜在药物:利用GC-MS分析技术检测COPD患者与健康志愿者的尿液,研究两组人群之间代谢小分子的差异性表达及其规律,以期发现新的诊断COPD的生物标志物,或者筛选出具有防治COPD的内源性代谢小分子。具体方法为:分别收集35例健康成人和36例COPD患者的晨尿,经过50%的甲醇水萃取、离心、过滤等样品前处理,采用进样口温度200℃,FID检测器温度200℃,EI方式离子化,全扫描范围(m/z):50-650等质谱条件分析,利用GC-MS检测上述各个标本,采用SIMCA14.1分析软件对各个样本的GC-MS图谱进行差异性分析,找出差异性较为显著性的小分子代谢标志物。实验结果表明,COPD患者和健康志愿者尿液中差异性表达显著的代谢物有9种,分别为:2-氧杂二[2,2,2]辛-6-醇,1,3,3-三甲基、烟酰胺、吲哚、苯甲酰胺、安息香酸、苯酚、4-乙烯基间二甲苯和二甲基砜(MSM)。根据文献调研汇总及预实验结果筛选,最终选择在健康志愿者尿液中高表达的MSM进行系统的药理学研究,其保留时间为20.432min,经过NIST14.0质谱标准库分析比对发现该峰对应的物质与二甲基砜的匹配度为96%,经过确认其为二甲基砜。第二章:研究MSM对LPS诱导炎症小鼠炎症的药理药效学作用:利用LPS诱导炎症小鼠模型,检测MSM对血清中炎症因子IL-1β、TNF-α及IL-6的影响;HE染色观察MSM对肺组织的影响,通过胸腺系数、脾脏系数及小鼠碳廓清实验观察MSM对小鼠免疫功能的影响。(1)MSM各剂量组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈下降趋势,且下降趋势具有剂量依赖性。100、300、900 mg/kg的MSM药物组分别使TNF-α表达量分别下调了12.3%(P0.01)、12.9%(P0.01)、17.0%(P0.01);使IL-6表达量分别下调6.3%、20.5%、24.2%(P0.05);使IL-1β表达量分别下调了4.5%、6.2%、20.1%。且900 mg/kg MSM剂量组对TNF-α的抑制能力强于DXMS阳性组。(2)HE染色结果表明,MSM对LPS诱导的炎症小鼠的肺组织具有保护作用:随着MSM剂量的增加,小鼠肺泡壁明显变薄,巨噬细胞和中性粒细胞浸润情况减轻。(3)MSM不影响LPS诱导的炎症小鼠的胸腺系数、脾脏系数,MSM各给药组的胸腺系数及脾脏系数与正常组比较无显著性差异,且小鼠碳廓清实验表明MSM具有提高机体免疫功能的作用。第三章:研究MSM对咪喹莫特诱导的银屑样小鼠的药理药效学作用:通过建立咪喹莫特诱导的银屑样小鼠模型,PASI评分和HE染色确认造模成功,检测MSM对各组小鼠血清中炎症因子IL-17F、IL-23、TNF-α的影响;PASI评分初步评价MSM对银屑样小鼠皮损组织的药理作用;并通过HE染色观察病理改变及征象,免疫组化进一步研究MSM对抗体IL-17F、IL-23、TNF-α及JAK2、STAT3和NF-κb的影响。(1)在咪喹莫特诱导的银屑样小鼠模型中,PASI评分初步显示出MSM对银屑样小鼠皮损组织的保护作用:皮层增厚程度减轻,皮损严重程度亦有所减轻。HE染色结果进一步证明MSM对银屑样小鼠的皮损组织有保护作用,表现为皮层增厚程度减轻、中性粒细胞和巨噬细胞浸润减少等改变。(2)MSM各剂量给药组血清中的IL-17F、IL-23较模型组均有极显著的抑制作用,300 mg/kg、900 mg/kg的MSM给药组血清中的TNF-α较模型组中含量有所降低。100 mg/kg、300mg/kg、900 mg/kg的MSM给药组对IL-17F的抑制率分别为80.9%(P0.01)、63.8%(P0.01)、59.6%(P0.01)。对IL-23的抑制率分别为13.8%、13.1%、12.5%。但不存在显著性差异。300 mg/kg、900mg/kg的MSM给药组对TNF-α的抑制率分别为18.8%、34.5%(P0.01)。(3)免疫组化结果也进一步证明了MSM对抗体IL-17F、IL-23、TNF-α、JAK2、STAT3和NF-κb(以上P值均小于0.01)的表达均具有明显抑制作用,最显著的是对STAT3蛋白的影响,产生了双向调节作用,即小剂量(100 mg/kg)上调,中高剂量(300、900 mg/kg)下调STAT3蛋白的表达。第四章:MSM免疫调节作用的分子机制研究:MTT法检验MSM有无细胞毒作用并确定无毒剂量,然后通过Western Blot法对MSM免疫调节作用进行机制研究,并选定MAPK信号转导通路进行分析研究。(1)MTT法结果显示:12.5、25、50μmol/L的MSM对MRC-5及RAW264.7细胞均无细胞毒作用。(2)利用LPS刺激RAW264.7细胞均可以显著上调MAPK通路中的p38、ERK、JNK的磷酸化水平,MSM对磷酸化的p38、ERK、JNK均有不同程度的抑制作用(P0.05),而且该抑制作用呈现剂量依赖性,但其对p38、ERK、JNK的上调与模型组相比无显著性差异。综上所述:利用GC-MS技术成功筛选出了健康人与COPD患者间差异性显著的物质二甲基枫,经过对其药理学效应及其机制进行的研究结果表明,MSM具有显著的免疫调节作用,该作用机制与MSM可抑制炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17F、IL-23、TNF-α的表达、下调JAK2、STAT3和NF-κb的蛋白表达,并抑制MAPK通路中的p38、ERK、JNK磷酸化水平有关。继续进行大样本研究分析,将确认MSM是否为抗炎、调节机体免疫平衡检测COPD的代谢小分子标志物,并为开发新型免疫调节剂防治COPD奠定理论基础。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

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图 2-1 COPD 患者与健康志愿者尿液的 GC-MS 总离子流图A:健康志愿者 B：COPD 患者Fig.2-1 TIC Graph of Urine from Patients with COPD and Healthy Volunteers by GC-MSA: Healthy Volunteers B: COPD Patients表 2-2 COPD 患者与健康志愿者尿液中常见检出物序号保留时间化合物英文名称1234511.00211.92912.43717.38619.5054-乙烯基间二甲苯乙酸2-乙酰基呋喃乙酰胺2-氧杂二[2，2,2]辛-6-醇，1,3,3-三甲基1-methyl-4-(1-methylethenyl)-BenzeneAcetic acid glacial2-AcetylfuranAcetamide2-Oxabicyclo[2.2.2]octan-6-ol,1,3,3-trimethyl-B

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反应组间离散程度的 Score Plot 得分图如图 2-2 所示。样本基本都分布在%置信区间的 Hotelling’s T2 的椭圆形中，表明 COPD 患者及健康志愿者这两尿液样本的稳定性和可重复性较好。且两个组间存在良好的分离趋势。初步证了 COPD 患者及健康志愿者尿液的代谢物存在显著差异。为进一步确定出两间的差异性代谢物，进行有监督的 OPLS-DA 分析方法。

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矩阵解释率；R2Y 反映的是建模的稳定性；Q2Y 反映模型的预测性；R2Y 与 Q2Y越接近 1，说明模型稳定性和预测性好）。健康志愿者的标本点落在图左侧绿色标记处，COPD 患者的标本点落在图右侧蓝色标记处。与 PCA 的结果一致，进一步验证了 COPD 患者及健康志愿者尿液的代谢物存在显著差异。

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