HNP-1的原核基因工程表达和抑菌机制研究

发布时间：2020-08-04 11:06

【摘要】：细菌耐药已成为危害全球公共卫生的严重问题。近年来全球抗生素的使用量不断增加,细菌耐药的发生与传播越来越严重,目前几乎所有的病原菌均呈现出抗生素耐药性,给全球医疗体系带来巨大的经济和社会负担。不幸的是,新型抗生素的开发远远赶不上耐药菌增长的速度,且随着抗生素使用量的大幅增加,出现细菌耐药性的时间也更为短暂。抗菌肽是开发新型抗生素的重要候选者。它们由宿主表达以消除入侵的病原体并增强免疫应答。其中人中性粒细胞蛋白(human neutrophil protein-1,HNP-1)是人中性粒细胞的主要抗菌肽分子,主要存在于人中性粒细胞的溶酶体颗粒内,是迄今发现含量最多的杀菌分子。HNP-1具有广泛的抗菌谱和极强的抗菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及腺病毒、流感病毒、艾滋病毒等均有很强的杀伤活性,有可能成为新一代抗菌药物,有助于解决细菌的耐药性和抗生素的毒副作用等问题。尽管HNP-1有广阔的应用前景,天然获取HNP-1的量极其有限,而化学合成HNP-1则由于其分子内含有3对二硫键,难以保证多肽折叠时正确配对,从而影响其生物活性。因此,研究者尝试通过各种融合表达策略进行基因工程表达,但是效果仍然不理想,很难使HNP-1形成正确的折叠。本课题研究HNP-1在大肠杆菌中有效表达、成熟过程及其杀菌机制,研究内容和结论主要包括以下三个方面:1.在大肠杆菌BL21(DE3)表达全长HNP-1过程中,会激活产生有杀菌活性的mature HNP-1:(1)用tricine gel体系比较IPTG诱导前、后蛋白表达的差异,发现诱导后蛋白样品在3.4kD附近出现明显的条带,切胶质谱鉴定为mature HNP-1的肽段,并用top-down MS进一步确认了 mature HNP-1生成;(2)随着IPTG诱导时间的延长,mature HNP-1表达量逐渐升高,而对应的活细菌数目却显著减少;(3)根据mature HNP-1分子量较小的特点,采用3kD超滤管对诱导后的全蛋白溶液进行超滤,得到纯化的mature HNP-1蛋白;(4)分别用纯化的preproHNP-1和matureHNP-1加入菌液中检测生长曲线,显示preproHNP-1没有抑菌活性,而mature HNP-1具有抑菌作用。2.HNP-1能够诱发大肠杆菌BL21(DE3)产生细菌程序性死亡:(1)采用非标定量蛋白质组学技术鉴定HNP-1参与抑菌过程的蛋白,根据诱导前、后差异蛋白的功能聚类,并结合文献报道推测HNP-1诱发了细菌程序性死亡过程;(2)TUNEL染色显示HNP-1促进DNA断裂;Annexin V染色显示HNP-1诱导使膜结构发生了显著变化,主要是内膜外翻;扫描电镜结果显示细菌表面产生了大量凋亡样小泡。上述经典表型实验确认HNP-1诱发大肠杆菌细菌程序性死亡过程。3.HNP-1通过和RecA结合,抑制其活性:(1)采用Ni-NTAbeads富集带有His-tag的HNP-1及其相互作用蛋白,经质谱鉴定,结合蛋白功能注释,筛选得到可能和HNP-1相互作用的蛋白RecA;(2)Western blot验证在HNP-1富集的相互作用蛋白溶液中存在RecA表达;又用RecA蛋白抗体富集其相互作用蛋白,在其中同样鉴定到HNP-1,从而正向和反向都确认了两者具有相互作用;(3)随着诱导时间延长,mature HNP-1逐渐替代了 preproHNP1和RecA结合,进一步说明是mature HNP-1和RecA相互结合为主;(4)通过分子对接软件ZDOCK和PyMoL预测RecA和mature HNP-1的结合位点,发现mature HNP-1正好能结合在RecA发挥重组修复活性的位点Asp-161和Ser-162,使RecA不能和DNA结合,抑制其活性;(5)采用体外实验证实加入10 μM mature HNP-1可以显著降低RecA和ssDNA的结合水平,抑制RecA酶活性。通过本项研究,我们发现大肠杆菌不能高效表达全长HNP-1的原因是会激活产生有杀菌活性的mature HNP-1。并通过超滤法获得了纯化的有活性的mature HNP-1,为批量生产mature HNP-1提供了一种操作简单和成本低廉的技术方案。我们的研究还揭示了 mature HNP-1在细菌内的作用靶点RecA。Mature HNP-1可以抑制RecA蛋白和ssDNA结合,从而抑制其SOS修复功能。RecA由于其具有的重要功能,已经成为抗耐药菌治疗的理想靶点。鉴于HNP-1在抑制RecA活性中的重要作用,有望成为新型抗耐药菌药物。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91
【图文】：

抗生素,人口大国,中低收入,低收入国家

新型抗生素的开发远远赶不上耐药菌增长的规模（图丨－３）。且随着抗生素使逡逑用量的大幅增加，目前几乎所有的抗生素都出现了抗性，人类面临缺乏可用抗生逡逑素的困境（图１－４）。逡逑＿一－一…’一逡逑７０－邋－二逦＿邋ＭＲＳＡ逡逑３０邋Ｈ邋Ｗ逡逑图１－３抗生素耐药性增加而新增抗生素数量下降［７］，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌逡逑（ＭＲＳＡ）、耐万古霉素肠球菌（ＶＲＥ）、耐氟喹诺酮铜绿假单胞菌（ＦＱＲＰ）逡逑

抗生素耐药性,耐万古霉素肠球菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,喹诺酮

逦２０１５逦－ｍｃｏｍｅ邋ｍｋｊｄｌｅ－ｉｎｃｏｍｅ逡逑图１－２全球抗生素消费２０００－２０１５，邋（Ａ）中低收入国家抗生素消费量增速更快；（Ｂ）在中逡逑低收入国家中的人口大国的抗生素使用总量增长迅速［５］。逡逑Ｊ逡逑２０１７年世界卫生组织公布了首份抗生素耐药“重点病原体”清单［６］。该清单逡逑特别强调了对多种抗生素耐药的革兰氏阴性菌的威胁。这些细菌具有寻找新方法逡逑抵抗抗生素治疗的内在能力，并且还可以广泛传播使其它细菌产生耐药的遗传物逡逑质。该清单根据新型抗生素的迫切需求程度将１２种耐药菌分为三个类别：极为逡逑重要、十分重要和中等重要。极为重要组中包括包括碳青霉烯类药物耐药鲍曼不逡逑动杆菌、碳青霉烯类药物耐药绿脓杆菌和碳青霉烯类药物耐药、产超广谱Ｐ－内酰逡逑胺酶肠杆菌科，这些细菌可引起严重且致命的肺部和血液感染。逡逑日益增加的耐药菌数量给全球医疗体系带来巨大的经济和社会负担。不幸的逡逑是，新型抗生素的开发远远赶不上耐药菌增长的规模（图丨－３）。且随着抗生素使逡逑用量的大幅增加，目前几乎所有的抗生素都出现了抗性，人类面临缺乏可用抗生逡逑素的困境（图１－４）。逡逑＿一－一…’一逡逑７０－邋－二逦＿邋ＭＲＳＡ逡逑３０邋Ｈ邋Ｗ逡逑图１－３抗生素耐药性增加而新增抗生素数量下降［７］，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌逡逑（ＭＲＳＡ）、耐万古霉素肠球菌（ＶＲＥ）、耐氟喹诺酮铜绿假单胞菌（ＦＱＲＰ）逡逑

耐药菌,抗生素

图１４耐药菌和所对应的抗生素ｒａ逡逑耐药菌使新型抗生素研发受阻逦‘逡逑图１－４所示，制药企业和科研机构对新型抗生素研发投入持续降低，药菌的出现使药物利润大幅减少。在开始加入致死剂量的抗生素能迅分对抗生素敏感的细菌群体，但是菌群中仍然存在少量以非常慢的速生长的残留细胞，称为持留菌（ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ），是形成抗生素耐药菌的关Ｉ逦ＩＩ逦１１１逦ＩＶ逡逑丨—ｓｎｓ邋＝＝邋0ｉｓ＾ｒ0ｍ逡逑Ｉ逡逑，逦ＩＶ逦ＩＶ逡逑

【相似文献】