时间分辨荧光纳米粒的制备和类过敏反应评价模型的建立及应用

发布时间：2020-08-05 09:39

【摘要】：目的:1、制备可用于时间分辨荧光免疫分析技术的荧光纳米粒。2、通过比较不同浓度吐温80溶液对RBL-2H3、P815、Ku812细胞脱颗粒的影响,筛选出一套灵敏、稳定的体外肥大细胞脱颗粒模型,并以筛选出的细胞模型探讨注射用益气复脉(冻干)类过敏反应。方法:1、以稀土元素铕与4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮合成的稀土配合物作为发光物质,以苯乙烯为聚合单体,通过乳液聚合法和分散聚合法分别制备时间分辨荧光纳米粒,通过马尔文粒径电位分析仪监测纳米粒的粒径及分散性,以紫外灯、荧光分光光度计分别检测纳米粒的显色情况和荧光强度。2、体外培养RBL-2H3、P815和Ku812细胞,测定三株细胞的生长曲线,在细胞生长对数期,以不同浓度(0.04、0.2、1、5、10、20、40、80 mg/ml)吐温80分别刺激三株细胞,采用中性红染色法显微镜下观察不同浓度吐温80溶液对三株细胞脱颗粒的影响,并计算脱颗粒百分率,同时以化学发光法、比色法分别检测组胺和β-氨基己糖苷酶释放率,以酶联免疫吸附法测定类胰蛋白酶的释放量;通过对比三株细胞系细胞脱颗粒指标的差异性,优选出一套最适合的细胞系作为体外肥大细胞脱颗粒的检测模型,以此考察注射用益气复脉(冻干)类过敏反应;并进一步检测吐温80和注射用益气复脉(冻干)对人的肥大细胞IgE释放的影响。结果:1、稀土元素铕与4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮合成的稀土配合物Eu(NTA)_3在紫外灯下显耀眼的红色,为Eu~(3+)的特征颜色,在荧光分光光度计上分析,荧光光谱表现出Eu~(3+)的特征峰;乳液聚合法制备的纳米粒粒径均一、可控,分散性较好(PDI0.1),但是在紫外灯下不显色;分散聚合法制备的纳米粒在紫外灯下显红色,激发光谱表现出Eu~(3+)的特征峰,但是分散性较差,经过反应优化(在反应时加入适量的交联剂),粒径分散性变好。2、三株肥大细胞脱颗粒模型中,各细胞的脱颗粒百分率、组胺释放率、β-氨基己糖苷酶的释放率和类胰蛋白酶释放量均随吐温80溶液浓度的增大而增多,在相同刺激条件下,Ku812细胞脱颗粒最灵敏,但在实验过程中发现Ku812细胞模型稳定性、可重复性较差,而RBL-2H3细胞的灵敏度虽次于Ku812细胞,但其稳定性、可重复性均优于Ku812和P815细胞。以RBL-2H3细胞考察注射用益气复脉(冻干)类过敏反应,注射用益气复脉(冻干)会引起细胞脱颗粒现象,且脱颗粒程度与浓度呈依赖性;临床等效浓度的注射用益气复脉(冻干)和红参、麦冬、五味子提取物对比,红参、麦冬、五味子提取物脱颗粒指标程度均不高于等效浓度的注射用益气复脉(冻干),但在三种主要成分中麦冬的脱颗粒程度较高,较接近注射用益气复脉(冻干)脱颗粒程度。另外,0.04-80 mg/ml的吐温80溶液以及临床给药浓度范围的注射用益气复脉(冻干)作用于Ku812细胞产生的IgE量均低于检测限。结论:1、本研究证明了4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮作为稀土元素铕的配体,能够有效地向中心离子Eu~(3+)传递能量,产生较强的荧光;乳液聚合法不适合制备时间分辨荧光纳米粒;分散聚合法适用于制备时间分辨荧光纳米粒,但在反应中需要加入交联剂,且交联剂的加入量对反应体系的分散性影响较大,这一发现为后续相关研究奠定基础。2、本文进一步确定吐温80、注射用益气复脉(冻干)诱导的过敏反应是不经过IgE介导的类过敏反应,随着吐温80浓度的增大,三个细胞模型脱颗粒现象显著,但相比于Ku812和P815细胞,RBL-2H3细胞更适合作为体外肥大细胞脱颗粒检测模型。注射用益气复脉(冻干)会引起类过敏反应,其主要成分红参、麦冬、五味子提取物均会引起类过敏反应,且发现麦冬是引起类过敏反应比较主要的成分,为注射用益气复脉(冻干)的生产研究部门提供一定的理论指导。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;R96
【图文】：

显色,纳米粒,体系,情况

天津医科大学硕士学位论文续表 1.40.21 150.73 1.37 00.28 134.93 0.61 00.33 119.23 0.93 00.39 90.90 0.78 00.50 78.43 1.01 0验数据发现，乳液聚合法适合制备 400nm 及其备的纳米粒分散性较好（PDI<0.1）；在实验中，随着 SDS 浓度的增大，纳米粒粒径逐渐减小色分析

纳米粒,紫外灯,反应体系,单体

天津医科大学硕士学位论文趋势，这是由于单体用量的增加，反应体系粘稠度增加，反应体系的分散介质对聚合物链的溶解性增加，导致低聚物临界链增长，使成核阶段形成的聚合物粒子数目减少，核上生长的单体增多，使纳米粒最终粒径增大［48］。（2）紫外灯下显色分析取透析处理后的荧光纳米粒，统一固含量为 0.0025%，各取样品 1ml 于1.5mlEP 管中，在紫外灯下照射，观察显色情况，结果如图 1.6 所示

纳米粒,倒置显微镜,荧光,图像

天津医科大学硕士学位论文与稀土配合物 Eu(NTA)3的最强发射波长一致，580.2 nm、593.4 700 nm 处较弱的的特征峰成球后变的更弱，图中几乎看不出来成球后阻力变大也可能是纳米粒中荧光配合物含量较低的原因。Eu(NTA)3 PS 荧光纳米粒的激发光谱相对于 Eu(NTA)3的激发光的蓝移，可能是由于稀土配合物与苯乙烯共聚，吸收的能量增加传递使中心离子能量发生变化，导致激发光谱蓝移，这也说明稀光谱的位置明显易受到体系环境因素的影响［49］。荧光倒置显微镜成像分析机选取上述 10 组中的几组纳米粒，透析后，稀释一定的比列，片上，轻轻盖上盖玻片避免气泡产生，避光存放 1-2h，待载玻片燥后，在荧光倒置显微镜以绿光为激发光源进行观察，实验结果米粒在荧光倒置显微镜下的图像为例进行分析，如图 1.8 所示。

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