蛇毒神经生长因子调控自噬诱导BMSCs成软骨分化的作用及其机制研究

发布时间：2020-08-12 18:19

【摘要】：目的:本课题展开研究广西眼镜蛇毒液生长因子(NGF)通过调控自噬诱导干细胞成软骨分化的作用,为进一步探讨NGF诱导干细胞软骨分化的分子生物学机制提供了实验支持。方法:实验分为三个部分:第一部分分组(1)空白对照组、(2)NGF组、(3)TGF-β组。NGF在体外诱导干细胞3天、5天、7天后进行以下指标检测:(1)细胞的生存情况检测:FDA/PI染色、DNA含量检测;(2)软骨分化指标检测:番红O染色、HE染色、糖胺聚糖(GAG)的含量检测、免疫荧光(一型胶原、二型胶原)、RT-PCR检验COL1A1、COL2A1、SOX9、ACAN表达量。第二部分分组(1)空白对照组、(2)NGF组、(3)TGF-β组、(4)Control+Ra(雷帕霉素)。体外诱导干细胞3天、5天、7天后进行以下指标检测:(1)Stub-RFP-Sens-GFP-LC3慢病毒转染监控自噬流;(2)透射电镜(TEM);(3)Western Blot检测LC3I/II、ATG5、ATG7、BECN-1、P62含量。第三部分通过基因芯片技术,筛选出与自噬相关的基因,具体实验如下:在通过RNA测序后,从大批量的数据中找出具有显著性差异表达的的基因,然后对差异基因使用生物信息学手段分析。然后通过RT-PCR验证相关基因的表达,查阅相关的文献,选出具有潜在意义和创新性的基因作为本课题的基因。通过质粒转染手段使沉默目的基因。转染的效率通过观察荧光的强弱和RT-PCR在基因水平上验证。转染成功后,培养正常的干细胞和基因沉默的干细胞,通过DNA含量的测定,FDA/PI染色、HE染色、GAG的含量检测、免疫荧光染色、RT-PCR、Stub-RFP-Sens-GFP-LC3慢病毒转染、透射电镜(TEM)、Western Blot等方法进一步的观察目的基因对NGF诱导干细胞成软骨分化过程的影响。结果:通过考察NGF在体外诱导干细胞成软骨分化,结果如下:(1)FDA/PI染色、DNA含量检测显示随着诱导时间的增加细胞数量越来越多;(2)通过检测软骨分化标志:番红O、HE、GAG的含量、免疫荧光(一型胶原、二型胶原)、RT-PCR(COL1A1、COL2A1、SOX9、ACAN),结果表明在NGF组和TGF-β组中出现了软骨细胞特异性特征,能够分泌软骨细胞外基质(糖胺聚糖和硫酸软骨素等),同时软骨特异性基因COL2A1、SOX9、ACAN明显上调;(3)通过自噬相关检测:RFP-GFP-LC3双荧光慢病毒检测;TEM结果表明在NGF组中比对照组相比可看到更多的自噬小体,Western Blot(LC3I/II、ATG5、ATG7、BECN-1、P62)结果显示NGF可以明显上调自噬关键蛋白。通过基因芯片技术,一些生物信息学手段对差异基因表达进行火山图分析、KEGG Pathway功能富集,筛选与自噬相关的基因进行热火图的分析,并绘制KEGG Pathway通路图、蛋白互作网络图更加直观了解与自噬有关的差异基因和干细胞分化的关联。RT-PCR验证结果显示,在NGF组中检测到了自噬相关基因的表达明显上调,说明干细胞在分化为软骨的过程中有自噬的发生。筛选出目的基因进行质粒转染,在培养8天后,绿色荧光表达明显。目的基因的表达通过RT-PCR检测,实验结果显示在正常组中目的基因的的表达水平明显高于基因沉默组(P0.05),表明基因沉默成功。在体外考察广西眼镜蛇毒液NGF诱导干细胞软骨分化的过程中,培养正常干细胞和基因沉默细胞在7天时,正常的干细胞在NGF诱导液的作用下软骨相关基因COL2A1、SOX9、ACAN的表达与基因沉默组相比具有明显差异(P0.05)。同时DNA的含量测定、HE染色、FDA/PI染色、GAG含量测定等进一步证实了RT-PCR的结果。而在自噬相关检测中NGF组的自噬表达水平明显高于基因沉默组。结论:通过上述实验结果表明广西眼镜蛇毒液NGF能够在体外诱导干细胞成软骨分化。基于基因芯片技术,筛选出的目的基因,通过质粒转染沉默,进一步证实了NGF在体外通过调控自噬诱导干细胞成软骨分化中发挥了一定作用,本实验结果为探讨NGF诱导干细胞成软骨分化的分子生物学机制提供了实验基础,将更好的应用在软骨修复。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

蛇毒神经生长因子调控自噬诱导BMSCs成软骨分化的作用及其机制研究 2018届硕士学位论文2.实验结果与分析2.1 MTT 法检测眼镜蛇毒 NGF 对 BMSCs 的增殖活性采用 MTT 试验测定 NGF 对骨髓间充质干细胞的毒性，不同浓度的 NGF 分别作用于干细胞，于 3d 后进行 MTT 试验检测。经检测发现，NGF（图 1-1）在浓度为 6μg/mL 其对应的 OD 值最大,对骨髓间充质干细胞的增殖作用最强。

蛇毒神经生长因子调控自噬诱导BMSCs成软骨分化的作用及其机制研究 2018届硕士学位论文2.2 HE 染色观察细胞形态图 1-2 为干细胞 HE 染色结果，蓝色为细胞核为苏木素所染；红色为细胞外基质为伊红所染。在 NGF 组与 TGF-β组中可以看见到典型的圆形或者椭圆状的细胞形状，还有明显的软骨陷窝结构，这与软骨细胞形态特征相似。而在空白对照组中没发现细胞呈软骨陷窝结构，且细胞数量明显少于其他组。各组随着培养天数的增加，在培养 7 天后，NGF 组中可观察到有明显的软骨陷窝结构，且细胞数量也显著增多。

蛇毒神经生长因子调控自噬诱导BMSCs成软骨分化的作用及其机制研究 2018届硕士学位论文2.3 FDA/PI 染色观察细胞活性检测各组活细胞和死细胞荧光染色，荧光显微镜下观察结果见图 1-3随着培养时间 3 天，5 天，7 天的增加，各组中绿色荧光强度都逐渐的增加，同时绿色荧光面积各组也都在逐渐增加，反映了各组的细胞都呈上升趋势。TGF-β组的活细胞数量优于或相近 NGF 组，NGF 组的活细胞数量多于 Control 组。这表明 NGF 能更好的支持骨髓间充质干细胞的生长。

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本文编号：2790862