Humanin衍生物HNG抗血小板抗血栓作用及机制的研究

发布时间：2020-08-13 04:30

【摘要】：研究背景:心脑血管疾病是人类致死和致残的主要原因之一。尽管人们在心血管疾病的诊断和治疗方面已做了坚持不懈的努力,但由于对发病机制认识的局限性,对心脑血管疾病的早期诊断、有效治疗和预防控制尚不满意。血栓在心血管疾病的发病机制中十分重要,是导致心肌梗塞和缺血性卒中的主要因素。血小板活化在血栓形成中发挥至关重要的作用。因此,研究抗血小板药物及其作用机制,有助于防治心脑血管疾病、降低发病率和死亡率、改善人民健康和生活质量。Humanin是一种具有抗凋亡作用的神经肽,其高效突变衍生物S14G humanin(HNG)的抗凋亡活性比HN高1000倍,不仅能阻断致阿尔茨海默病(FAD)因子-β淀粉样肽(Aβ)引起的细胞死亡,而且对缺血性卒中、心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化均有保护作用。血小板参与上述疾病的发病过程,提示HNG也可能通过影响血小板参与这些疾病。因此,本课题探讨HNG对血小板活化,动脉血栓形成和器官损伤后血栓炎症的作用及机制。研究目的:探究HNG是否影响血小板活化及其作用靶点,是否影响血栓形成和器官损伤导致的血栓性炎症。研究方法:1、研究HNG对血小板活化的影响。(1)血小板聚集实验:用HNG或对照溶剂预处理胶过滤分离的人血小板10分钟,然后在血小板聚集仪中,用血小板激动剂(包括胶原,CRP,凝血酶,AYPGQV或ADP)刺激5分钟,分别得到血小板聚集曲线。(2)血小板颗粒释放:取人胶过滤血小板,用HNG或对照溶剂预处理10分钟后,用血小板聚集仪检测ATP释放(致密颗粒释放);用流式细胞仪检测血小板表面P-selectin的表达(α颗粒释放)。(3)血小板内向外和外向内信号通路:取人胶过滤血小板,用HNG或对照溶剂预处理10分钟后,分别检测:内向外信号通路,利用流式细胞仪检测血小板表面整合素αIIbβ3的活化。外向内信号通路,活化的血小板整合素αIIbβ3触发血小板外部信号传导,包括血栓稳定所必需的激酶级联反应和细胞骨架重组。为了评估HNG是否影响血小板外向内信号,将预处理的血小板在固定的纤维蛋白原上铺展和粘附,一定时间后用细胞骨架染料鬼笔环肽染色,计算血小板铺展后的面积。(4)血小板信号分子磷酸化:利用免疫印迹Western blot方法检测了HNG预处理后血小板内信号分子的磷酸化水平的变化。2、研究HNG对血栓形成的影响以及出血倾向。为了探索HNG对血栓形成和稳定的影响,我们将从体外和体内两方面入手,体外通过流体小室(flow chamber),体内通过颈动脉损伤血栓模型来检测HNG在血栓形成中的作用。(1)流体小室实验(Flow chamber):本实验使用的仪器是BioFlux200系统。BioFlux孔板通道先用200μg/ml的Ⅰ型胶原蛋白包被1小时。取柠檬酸钠抗凝的人全血,并用荧光剂Calcein-AM标记,在10dyn/cm~2的剪切应力下使血小板在胶原包被的表面上流动,用倒置荧光显微镜记录血小板在孔板通道中的聚集反应。(2)氯化铁诱导颈动脉损伤模型:本研究将利用氯化铁诱导颈动脉损伤模型观察HNG预处理后大动脉的血栓形成。方法:钝性剥离小鼠的左颈动脉,7.5%FeCl3浸泡2分钟。用Visual Sonics View 2100超声仪的多普勒模式探测器记录动脉血流30分钟,观察损伤30分钟内血管有无阻塞和初次阻塞所需时间。本实验的动脉损伤模型比较简单,但是每只小鼠的个体差异都是一个陷阱。所以,要使用相对大量的小鼠,每组至少10只小鼠。(3)对生理止血的影响:剪尾出血实验:麻醉小鼠后,剪掉5mm尾巴,立即放入37℃生理盐水中,观察其尾部出血时间,记录第一次出血时间以及再次出血时间及其间隔。HNG给药组和对照组小鼠每组至少10只。3、检测HNG在心肌缺血再灌注(I/R)诱导的血栓炎症中的作用:越来越多的实验证据表明,血小板是免疫细胞库的一部分,特别是血小板和白细胞之间的相互结合影响着炎症组织的损伤程度,成为免疫反应的共同特征。本课题研究了HNG对心肌缺血再灌注后血栓炎症的影响。(1)小鼠心肌缺血再灌注损伤模型:手术前1小时腹腔注射HNG(0.2mg/kg)或生理盐水对照,然后进行心肌缺血手术以及假手术(sham)对照组,缺血45分钟后再灌注10分钟或2小时,取全血和心脏,进行后续试验检测,其中,使用伊万斯蓝Evans Blue和TTC染色确定心脏梗死面积。心肌未染蓝色区域(危险区域,AAR),心肌Evans Blue染蓝色区域(非危险区域,ANAR),TTC染色区域(红色)以及TTC未染色区域(梗死区域IA,白色)均使用Image J软件进行分析处理。心肌梗死面积用梗死区域与危险区域(AAR)的百分比(IA/AAR)来表示,而AAR面积则通过AAR与左心室总面积(AAR/AAR+ANAR)之间的比例来表示。(2)HNG对心肌缺血再灌注诱导的血栓炎症的影响:本课题利用流式细胞仪分别检测心肌缺血再灌注后,HNG对小鼠体循环血液中血小板P-selectin表达,活性氧ROS的产生以及血小板-白细胞聚集体的影响。4、评估HNG在血小板上的作用靶点:(1)筛选HNG在血小板上的靶点:本课题使用亲和素-抗亲和素纯化的方法将血小板上可能与HNG结合的蛋白筛选出来,然后进行质谱分析鉴定HNG的潜在靶点,并对质谱结果进行KEGG通路富集分析、GO功能分析和蛋白相互作用(PPI分析)等生物信息学分析。(2)分子对接:HNG(2GD3)的蛋白质结构模型由RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载。人β1微管蛋白结构由ModBase server人β2微管蛋白晶体结构(RCSB PDB:4I4T)同源重构得到。HNG-tubulinβ1结合用ZDOCK(http://zdock.umassmed.edu/)软件完成,并通过FiberDock评分(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/FiberDock/)。(3)免疫沉淀和免疫荧光实验评估HNG能否通过靶向微管蛋白β1-tubulin发挥稳定血小板微管的作用:亲和纯化和免疫印迹实验:将生物素标记的HNG与血小板裂解液孵育后,用抗生物素的琼脂糖纯化与HNG结合的蛋白,做免疫印迹实验,用微管蛋白β-tubulin杂交。免疫荧光实验:胶过滤的血小板与HNG孵育后,然后用β1-tubulin抗体进行染色,并使用激光共聚焦拍照,观察HNG与β1-tubulin的共定位。微管解聚测定:将HNG预处理的血小板与微管解聚药,诺考达唑,在37℃下孵育。或者,在固定之前使血小板粘附于纤维蛋白原包被的载玻片。使用抗β1-微管蛋白和抗乙酰化微管蛋白的抗体染色,观察微管解聚情况。研究结果:1、HNG抑制血小板活化。(1)HNG抑制血小板聚集:为了确定HNG对血小板功能的影响,将分离的人血小板与HNG或对照溶剂预孵育,并用胶原,convulxin,凝血酶和AYPGQV等激动剂刺激血小板。结果显示:HNG剂量依赖性地抑制胶原引起的血小板聚集,在10μM时聚集减少58%(P0.01,每组n=8)。HNG也抑制由convulxin(P0.01),ADPAYPGQV(P0.05)和凝血酶(P0.05)引起的血小板聚集。(2)HNG抑制血小板P-选择素表达和ATP分泌:血小板激活导致以表面P-选择蛋白表达为特征的α-颗粒的胞吐作用。流式实验结果显示,HNG显著抑制了convulxin诱导的P-选择素表达增加(P0.01)。此外,我们还评估了血小板致密颗粒中ATP的释放,与对照组相比,HNG处理血小板后能显著降低胶原和convulxin诱导的ATP释放(分别是P0.05和P0.01)(3)HNG抑制血小板整合素αIIbβ3活化以及在纤维蛋白原上的铺展:流式细胞术实验结果显示与scramble-HNG组及溶剂对照组相比,HNG显著降低了蛇毒convulxin和CRP诱导的血小板表面纤维蛋白原水平,即整合素αIIbβ3的活化(P0.05)。血小板铺展实验结果显示与HNG孵育后也能显著降低血小板的铺展面积(P0.05)。(4)HNG抑制血小板中Akt/Erk1/2信号传导:由于HNG能够抑制由不同激动剂诱导的血小板聚集,因此我们探讨了其抗血小板的细胞内激酶信号传导。免疫印迹实验结果显示,HNG能显著降低由胶原诱导的Akt和Erk1/2的磷酸化水平。同时HNG能轻度降低p38MAPK的磷酸化,但是没有统计学意义。2、HNG发挥抗血栓作用且在有效作用剂量是不增加出血风险的。(1)HNG抑制在流动条件下胶原蛋白上的血小板粘附:流动小室实验显示HNG显著降低胶原表面的血小板粘附(P0.01)。(2)HNG抑制体内血栓形成:我们检测了HNG在小鼠颈动脉损伤模型中的抗血栓作用。颈动脉血流的超声观察显示小鼠腹腔注射HNG(25μg/kg,n=13)后,能够延长初始血栓的闭塞时间(P0.05)。(3)HNG不增加出血风险:为了确定HNG对止血的作用,我们进行了小鼠尾部出血和颈静脉出血测定。与对照组相比,HNG处理组小鼠的出血时间并没有明显延长。3、HNG能降低心肌缺血再灌注小鼠的血栓性炎症损伤。(1)TTC染色发现HNG降低了小鼠I/R后心脏的梗塞面积(P0.05)。(2)利用流式细胞术实验发现,HNG减弱了I/R损伤后的血栓炎症。HNG能降低心肌I/R后引起的循环血小板P-选择素表达(P0.01),活性氧ROS产生(P0.01)和血小板-白细胞聚集物增加(P0.05)。4、HNG可能与血小板β1-微管蛋白结合并稳定血小板微管。(1)质谱:我们使用生物素-抗生物素蛋白亲和纯化实验从人血小板中提取出HNG潜在的结合蛋白,并进行银染、切胶、质谱分析,发现了几种与HNG结合可能性较大的蛋白,包括在血小板功能和AZD中都发挥重要作用的β1-微管蛋白。(2)分子对接揭示HNG与β1-微管蛋白结合,并且结合位点与现有的微管稳定剂紫杉酚结合位点不同。(3)使用生物素-抗生物素蛋白亲和纯化从人血小板中取出HNG结合蛋白,并且使用免疫共沉淀western印迹发现HNG与β1-微管蛋白结合。(4)通过共聚焦免疫荧光染色观察到在血小板中β1微管蛋白与HNG存在共定位。(5)HNG抑制血纤维蛋白原刺激的血小板微管解聚或微管去稳定剂诺考达唑处理引起的微管解聚。研究结论:1、HNG抑制血小板活化和血栓形成,且无明显出血倾向。2、HNG的作用机制可能是稳定微管,其抑制血小板活化的其中一个靶点可能是β1-微管蛋白。3、HNG可能通过抑制血小板活化来抑制血栓炎症发挥心肌缺血的保护作用。4、这些发现提示了HNG在心脑血管疾病防治中的潜在应用前景。为未来HNG作为抗血小板抗血栓药物的转化开发提供了新的实验依据。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

血小板聚集,刺激剂

一、HNG 抑制血小板活化1.HNG 抑制血小板聚集血小板聚集实验是反映体外血小板活化功能最重要的指标，因此，为了检测HNG 对血小板功能是否有影响，我们将分离人胶过滤血小板（2×108/ml）与 HNG（4, 8,10μM）或对照溶剂水，在 37℃预孵育 10 分钟，并用血小板刺激剂，胶原，convulxin，凝血酶和蛋白酶活化受体 PAR4 刺激剂 AYPGQV 等刺激血小板活化。结果显示 HNG 剂量依赖性地抑制各种刺激剂引起的血小板聚集。其中，2μg/ml胶原引起的血小板聚集，在 HNG10μM 处理后聚集减少了 58％（P<0.01,每组 n =8）。此外，HNG 也能抑制由 4nM 蛇毒 convulxin（P<0.01），300μM AYPGQV（P<0.05）和 0.01U 凝血酶（P<0.05）引起的血小板聚集（见图 1）。以上结果证明 HNG 能抑制 ITAM 受体和 G 蛋白偶联受体引起的血小板聚集。

致密颗粒,血小板,血小板活化,整合素

34图 2 HNG 对血小板 α 颗粒和致密颗粒分泌的影响。流式细胞术监测血小板 P-选择蛋白的表达。（A，B）图示峰形图是三个独立实验的代表图。统计图是平均值±SEM；n=3。* P<0.05， ** P<0.01，非配对 t 检验。（C）血小板活化释放 ATP。图 3C 分别是在胶原和 convulxin 刺激下血小板释放 ATP 的曲线图，为 3 次以上实验中的一次代表图。统计图是根据 ATP 标准品计算的 ATP 释放量（nmol），是平均值±SEM; n≥3;* P<0.05，配对 t 检验。3. HNG 抑制血小板整合素 αIIbβ3 的活化以及在纤维蛋白原上的铺展前面的实验结果已经显示 HNG 能抑制血小板的颗粒释放，接下来，为了测试HNG 是否影响血小板整合素 αIIbβ3（在血小板活化过程中的一个关键步骤）的内向外活化，我们将人胶过滤的血小板先与 HNG 或溶剂对照在 37℃预孵育 10 分钟，

血小板释放,胶原,血小板,曲线图

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