【摘要】：目的探讨胰激肽原酶(pancreatic kallikrein,PK)对他克莫司(tacrolimus,TAC)诱导的大鼠肾脏损伤的保护作用及其机制。方法体内实验:48只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组(每组12只),正常对照组(VH):橄榄油lmL/kg/day皮下注射和生理盐水2mL/kg/day腹腔注射;VH+PK组:橄榄油 lmL/kg/day 皮下注射和 PK7.2u/kg/day 腹腔注射;TAC 组:TAC1.5mg/kg/day 皮下注射和生理盐水2mL/kg/day腹腔注射;TAC+PK组:TAC1.5mg/kg/day皮下注射和PK7.2u/kg/day腹腔注射,各组给药共4周。4周后收集各组大鼠24小时尿液,使用全自动尿液分析仪检测24h尿蛋白(Urinary protein,UPRO);右侧颈内静脉采血,使用全自动生化分析仪检测血肌酐(Serumcreatinine,Scr)及血尿素氮(Bloodureanitrogen,BUN)及TAC血药浓度;利用腹腔内葡萄糖耐受试验(Intraperitoneal Glucose tolerance test,IPGTT)检测大鼠 Omin、30min、60min、90min、120min血糖并根据各时间点血糖值计算葡萄糖曲线下面积(Area under the curve of glucose,AUCg);使用ELISA法测定各组大鼠血清8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)的表达和尿 8-OHdG 排泄率。采集肾组织标本,常规石蜡包埋和切片,Masson染色法观察肾间质纤维化程度(Tubulointerstitial fibrosis,TIF);PAS染色观察肾小球病变;使用电子显微镜观察肾组织的超微结构变化;使用TUNEL染色法观察肾组织中的凋亡细胞;利用免疫组化法检测肾组织中肾母细胞瘤蛋白抗体(Wilms Tumorprotein 1,WT-1)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、外胚层发育不良抗体(Ectodermal Dysplasial,ED-1)和锰超氧化物歧化酶(Manganese-containingsu2 peroxidedismutase,MnSOD)。使用免疫印迹法检测肾组织中转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、MnSOD、白介素 6(Interleukin-6,IL-6)、血红素氧合酶 1(Hemeoxygenase-1,HO-1)、NADPH 氧化酶 2/4(NADPHOxidase2/4,NOX2/4)、自噬相关因子轻链蛋白 3B(Light chainprotein3B,LC3B)、P62、Beclin、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bc12-associatedXBax)和 B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma2,Bcl-2)的表达。体外实验:体外培养HK-2细胞株,将HK-2细胞分组为对照(Control,CON)组、PK(6pg/mL)组、TAC(50ug/mL)组和 TAC(50ug/mL)+PK(6pg/mL)组每组分别处理时间24h。使用细胞增殖-毒性检测法(CCK-8)测定各组细胞活力;二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)荧光结合流式细胞法检测细胞内活性氧(ROS)的产生;免疫印迹法检测Bcl-2、Bax、LC3B和Beclin的表达。结果体内实验1.与VH组相比,TAC组大鼠的体重明显降低,24h尿量、24h尿蛋白定量、血肌酐和血尿素氮均升高(均P0.05),与TAC组相比,TAC+PK组大鼠体重增加,24小时尿蛋白定量、血肌酐和血尿素氮均降低(均P0.05)。2.与VH组相比,TAC组糖耐量明显异常;与TAC组相比,TAC+PK组糖耐量异常改善(均P0.05)。3.与VH组相比,TAC组肾小管损伤明显,TIF加重;TAC+PK治疗组肾小管损伤减轻,TIF减轻,差异均具有统计学意义(均P0.05)。4.与VH组相比,TAC组肾小球系膜区面积扩大,肾组织中WT-1表达降低;与TAC组相比,TAC+PK组小球系膜区面积缩小,肾组织中WT-1表达升高,差异均具有统计学意义(均P0.05)。5.与VH组相比,电镜观察TAC组肾小管及肾小球损伤明显,而与TAC组比较,TAC+PK组肾组织超微结构改变有不同程度改善。6.与VH组相比,TAC组的TGF-β1表达明显升高。与TAC组相比,TAC+PK组TGF-β1表达降低,差异均具有统计学意义(均P0.05)。7.与VH组相比,TAC组的血清和尿8-OHdG含量增加、促氧化因子(NOX2、NOX4)表达增加,抗氧化因子(MnSOD)表达降低;与TAC组相比,血清、尿氧化应激产物8-OHdG降低、TAC+PK组促炎因子(NOX-2、NOX4)表达降低,抗氧化因子(MnSOD)表达增加,差异均具有统计学意义(均P0.05)。8.与VH组相比,TAC组促炎因子(ED-1\OPN\IL-6)表达增加,抗炎因子HO-1表达降低;与TAC组相比,TAC+PK组促炎因子(ED-1\OPN\IL-6)表达降低,抗炎因子HO-1表达增加,差异均具有统计学意义(均P0.05)。9.与VH组相比,TAC组的自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、P62、Beclin的表达增加;与TAC组相比,TAC+PK组LC3B-Ⅱ、P62、Beclin的表达降低,差异均具有统计学意义(均P0.05)。10.与VH组相比,TAC组的TUNEL阳性细胞数增加,Bcl-2/Bax 比值降低;与TAC组相比,TAC+PK组TUNEL 阳性细胞数降低,Bcl-2/Bax 比值升高,差异均具有统计学意义(均P0.05)。体外实验1.与CON组相比,TAC组HK-2细胞活力降低;与TAC组相比,TAC+PK组HK-2细胞活力增加,差异均具有统计学意义(均P0.05)。2.与CON组相比,TAC组ROS表达增加;与TAC组相比,TAC+PK组ROS表达降低;差异均具有统计学意义(均P0.05)。3.与CON组相比,TAC组细胞自噬增加,LC3B-Ⅱ、Beclin表达增加;与TAC组相比,TAC+PK组LC3B-Ⅱ、Beclin表达降低,差异均具有统计学意义(均P0.05)。4.与CON组相比,TAC组细胞凋亡增加,Bcl-2/Bax 比值降低;与TAC组相比,TAC+PK组Bcl-2/Bax 比值升高,差异均具有统计学意义(均P0.05)。结论在体内及体外实验中胰激肽原酶对他克莫司诱导肾小管间质纤维化、肾小球损伤具有保护作用,其机制与胰激肽原酶抑制TGF-β1表达、抗氧化应激、抗炎、调节自噬、抗凋亡以及降低血糖有关。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965
【图文】：
图２各组大鼠ＡＵＣｇ的比较逡逑ＶＨ正常组；ＰＫ胰激肽原酶；ＴＡＣ他克莫司逡逑
图３．Ｂ各组大鼠肾组织ＴＩＦ程度比较逡逑
图４．Ｂ各组肾小球系膜区面积比较逡逑ＶＨ正常组；ＰＫ胰激肽原酶；ＴＡＣ他克莫司逡逑
【参考文献】
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2803973
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