植物内生真菌来源纤溶酶的筛选及其酶学特性的探究

发布时间：2020-08-27 16:59

【摘要】：血栓性疾病是由血栓形成和栓塞两种病理性变化所引起的疾病,近年来,血栓性疾病的发病率在世界范围内迅速增加,而且致残率和致死率均较高,严重危害着人类的生命健康。在过去十几年中,溶栓药物已经广泛应用于血栓性疾病的治疗中,基于这些药物的溶栓机制,可以将其分为两种类型:一种是纤溶酶原激活剂,另一种是纤溶酶样的蛋白。但是,尽管这些溶栓药物在血栓的预防和治疗过程中发挥了一定作用、而且应用广泛,却存在不容忽视的缺点:如过度纤溶引发机体出血、对纤维蛋白的底物特异性较低、以及价格昂贵等。因此,寻找更安全有效且价格低廉的溶栓药物仍然是一个迫切需要解决的问题。在过去十几年的研究中,微生物来源的新型溶栓剂展现出良好的特性,逐渐引起研究人员的浓厚兴趣。如纳豆激酶。近年来也有过自真菌的代谢产物中发现具较高纤溶活性蛋白的报道,如黄曲霉(Aspergillus ochraceus),尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等。内生真菌是一个比较特殊而且很重要的群体,目前在内生真菌与溶栓药物方面的研究报道较少。本实验研究自植物内生真菌中筛选获得一株高产纤溶酶菌株,分离、纯化目的酶,并对其酶学特性进行研究。为寻找新型纤溶酶用于溶栓药物的开发提供了新的资源。自采集的植物标本中共分离纯化获得486株植物内生菌,以脱脂奶粉平板为初筛模型,首先筛选获得产蛋白酶的菌株;以纤维蛋白平板为复筛模型,进一步筛选获得产纤溶酶的菌株,最终自486株植物内生菌中筛选获得一株高产纤溶酶的菌株,通过形态学和分子生物学鉴定方法的结合,鉴定产酶菌株为露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)。将多种蛋白纯化的方法相结合,自菌株发酵粗提取液中分离纯化目的酶,最终确定纯化流程为:发酵粗提液→硫酸铵沉淀→透析→阴离子交换层析→阳离子交换层析→Native-PAGE。对其中每个纯化步骤的条件进行优化。最终确定纯化条件为:硫酸铵沉淀最优区间为50%~70%;透析脱盐缓冲液为0.1M、pH(7.2~7.4)的Tris-HCl;阴离子交换层析:填料为DEAE-Sepharose FF、缓冲体系的pH为6.5;阳离子交换层析:填料为Sepharose-6FF,缓冲体系pH为4.5;通过Native-PAGE电泳进一步提高目的酶的纯度,切胶回收进行蛋白质谱鉴定,结果分析该酶属于肽酶M36家族。对目的酶的酶学特性进行研究。通过SDS-PAGE蛋白电泳初步估算出目的酶的分子量约为30kDa;通过纤维蛋白平板检测活性,检测了温度、pH、金属离子、蛋白酶抑制剂等对酶的活性的影响,结果发现目的酶的最适作用温度在40℃左右,而且在37℃下孵育4h以上仍能保持较高的酶活,推测该酶可以适应人体的温度环境;酶在pH3~11之间均能保持一定的活性,具有广泛的pH适应性;金属离子对酶的活性影响不明显,推测该酶能够适应人体比较复杂的离子环境;通过纤维蛋白平板检测活性和SDS-PAGE蛋白电泳,对酶的激酶活性和底物专一性进行研究,结果发现酶可以直接水解纤维蛋白发挥溶栓作用;酶对纤维蛋白原具有水解作用,具有预防血栓形成的潜能。通过体外模拟胃液环境,进一步确定该纤溶酶在较低pH(3~5)的环境下仍能保持一定活性;采集大鼠静脉血制作血凝块,体外模拟溶栓实验,进一步验证该纤溶酶确实具有溶解血栓的能力;同时实验观察了酶对血管内皮细胞(HUVEC)形态的影响,结果在实验剂量的纤溶酶的作用下,HUVEC的细胞形态发生明显变化。以上实验为接下来对该纤溶酶进一步的药效学研究提供了数据参考。综上,本实验研究自植物内生真菌中筛选获得一株高产纤溶酶菌株,菌株鉴定为露湿漆斑菌(Myrothecium roridum);优化出分离纯化该纤溶酶的合适条件;对其酶学特性进行研究,发现该酶能够适应人体的温度环境(37℃耐受)和复杂的离子环境;该纤溶酶的分子量较小,容易被吸收;可以通过直接降解纤维蛋白发挥溶栓作用、具水解纤维蛋白原的活性,推测该酶兼有预防和治疗血栓的潜能;同时该酶具有较广泛的pH适应性(pH3~11),推测该酶兼有开发成为口服和静脉注射用药的潜能;另外,本实验中体外模拟血栓溶解实验、细胞毒性实验为对该纤溶酶进一步的药理、药效学研究提供了一定的基础数据。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R915
【图文】：

过程图,血液凝固,过程,凝血酶

第一章绪论凝血系统血液凝固是一系列比较复杂的化学连锁反应过程，最终血液由流动的状态变不流动的凝块，参与各个连锁反应的物质组成了凝血系统，这些物质即为凝子[10,13]。血液凝固过程中，一系列的凝血因子相继被激活。凝固的过程大致可以分为阶段[10]（图 1.1）。第一阶段形成凝血酶原激活物。第二阶段形成凝血酶，凝原激活物在 Ca2+的参与下，催化凝血酶原转换为有活性的凝血酶。第三阶段纤维蛋白，即血栓的基质。凝血酶作用于纤维蛋白原，生成纤维蛋白单体相互结合，在凝血因子 XIIIa 的作用下形成纤维蛋白多聚体，即纤维蛋白

过程图,过程,纤溶系统,凝血块

第一章绪论.2.2 纤溶系统血栓形成是当血液中的凝血机制被过度地激活，血小板以及被激活的凝血相互作用，从而形成了具有一定结构且较稳定的凝血块，在机体纤溶系统的下，这些凝血块能够被缓慢地降解[12]。哺乳动物可以通过纤溶系统来维持血凝血与溶解的平衡，探究纤溶系统的溶栓机制对溶栓药物的研发具有重要的[12,13]（图 1.2）。纤溶酶原激活剂（Plasminogen activator，PA）激活纤溶酶原（Plasminognelg)，使之变为有活性的纤溶酶((Plasmin，Pl)，凝血块中的主要基质为纤维蛋Fibrin，F），纤溶酶可以直接将纤维蛋白溶解，使之不能在血管中长期存在防止血栓的形成[14]。现行的大部分溶栓药物都是纤溶酶原激活剂类似物，通活纤溶酶原转化成纤溶酶，对血栓进行溶解。

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