FC-99通过miR Let-7a-5p调控单核细胞缓解小鼠肝损伤

发布时间：2020-10-14 17:18

　　背景:肝脏是脓毒症主要累及的器官,脓毒症患者的肝损伤发生率高达19%,通常死亡率高发且预后不良。研究表明,循环来源的单核细胞在内毒素等刺激下浸润至肝脏,随后分化为巨噬细胞,促进炎症介质(如TNF-α,IL-1β和IL-6)和氧自由基(如NO)等的释放,诱发肝功能障碍甚至肝衰竭。故单核/巨噬细胞分化结局与脓毒症肝功能损伤密切相关。临床上对应对脓毒症性肝损伤的手段有抗生素、抗炎、抗氧化和提高血液灌流等,但疗效有限、预后较差,亟需开发有效的治疗策略和药物。前期研究发现,FC-99(N1-[(4-methoxy)methyl]-4-methyl-1,2-benzenediamine)是新型1,2-苯二胺类衍生物,具抗炎活性,可改善脓毒症小鼠肝脏病理结构损伤,大大提高小鼠存活率。然而,FC-99缓解肝损伤的作用靶点和潜在机制尚未明确。许多研究表明,MicroRNAs是细胞生存/分化/凋亡等多种生物反应的重要调节因子,能识别靶基因信使RNA的非转录区域并与之结合,达到促进其降解或阻止其翻译的目的,最终抑制靶基因的产生。我们通过miRNAs表达谱芯片比较FC-99给药前后对LPS刺激下的单核巨噬细胞差异表达miRNAs的影响,发现包括miR let-7a-5p在内的9个miRNAs差异高表达,又经体外实验初步验证了这一现象。提示,FC-99可能通过let-7a-5p发挥缓解肝损伤的作用。目的:旨在采用盲肠结扎穿孔(CLP)法诱导小鼠肝损伤,给予FC-99进行干预处理,评价FC-99对脓毒症小鼠的肝治疗作用;分析其对外周血和肝组织中单核/巨噬细胞百分比的影响;采用干扰和过表达技术进行体内外试验,探索FC-99对单核/巨噬细胞分化过程中let-7a-5p/Bcl-XL表达与凋亡的关联及作用机制。方法:1.获取48只雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄)。CLP手术后12、24和72h行与假术组相同的操作,每个时间点共16只小鼠,每组8只,收集肝脏,RT-QCR法检测let-7a-5p和Bcl-XL水平。2.首先,另取64只上述小鼠分为:假术组、CLP组、假术+ FC-99组和CLP + FC-99组,每组16只,随机分配。CLP + FC-99组和假术+ FC-99组小鼠在术前2h进行腹腔注射FC-99(10mg/kg),其余两组小鼠则腹腔注射同等体积的DMSO。术后24h,收集每组各8只小鼠的血液和腹腔灌洗液,检测细菌负荷量;分离血浆检测TNF-α、IL-6、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平;收集肝脏制备组织切片,用HE法、TUNEL法观察肝组织病理和肝细胞凋亡改变、RT-QCR法检测肝脏中炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6等基因表达水平;收集血液和肝脏,流式细胞术检测单核/巨噬细胞百分比;术后7天,每组各取8只小鼠,观察其生存情况并记录存活率。然后,用佛波酯(PMA)和/或VD3诱导THP-1和HL-60单核/巨噬细胞转化。利用miRNAs表达谱芯片技术、TargetScan靶点预测、AnnexinV/PI流式细胞术、RT-QPCR和萤光素酶报告实验分析FC-99对let-7a-5p/Bcl-XL、Caspase3凋亡效应蛋白表达的影响。通过Graph Prism5统计软件进行双因素方差t检验,p0.05表明不同组别间具有显著差异。结果:1.与CLP组相比,FC-99提高CLP小鼠的生存率(p0.01),显著减少术后24h腹腔以及血液中的细菌负荷水平(P0.001)、血浆TNF-α、IL-6、ALT和AST水平,显著缓解肝脏病理结构变化和肝细胞凋亡比例(P0.01),大幅降低肝内细胞因子TNF-α等的mRNA水平(P0.01),降低外周血促炎性Ly6Chi单核细胞和肝脏中F4/801o单核来源巨噬细胞比例(P0.01),诱导CD11b+细胞凋亡。提示:FC-99促进肝内单核细胞凋亡、减少F4/801o单核来源巨噬细胞缓解脓毒症肝损伤。2.FC-99诱导THP-1细胞分化中Annexin V+细胞、未活化caspase3蛋白表达显著增加(P0.01),巨噬细胞表面markerCD11b、CD14的阳性率(P0.05)和mRNA水平均显著降低(P0.01),Giemsa形态分析显示单核样细胞增多而巨噬样细胞减少;VD3预处理过的HL-60单核细胞的CD11b和CD14阳性率及基因表达均显著升高(P0.05)。提示:FC-99可促进单核细胞凋亡,阻断单核/巨噬细胞分化。3.与CLP组比较,FC-99治疗组let-7a-5p表达显著回升(P0.001),Bcl-XL表达水平则降低(P0.05);LPS处理的RAW264.7细胞中let-7a-5p的表达明显下调(P0.05),而Bcl-XL在前6h的基因水平明显增加(P0.05)。这与体内实验结果趋势一致;在PMA诱导分化的THP-1中转染let-7a-5p模拟物或抑制剂,其凋亡水平随let-7a-5p水平高低而增减,Bcl-XL表达与let-7a-5p表达相反。提示:FC-99诱导let-7a-5p抑制Bcl-XL的产生。4.FC-99有效降低let-7a-5p inhibitor提高的CD11b+和CD14+细胞比例和CD11b、CD14基因水平,逆转由于let-7a-5p下调导致的Bcl-XL表达升高以及巨噬细胞比例的增加。提示:FC-99靶向miRlet-7a负调控抗凋亡蛋白Bcl-XL,促进单核细胞分化过程中的凋亡,抑制其分化。结论:FC-99通过上调let-7a-5p表达水平,减少抗凋亡蛋白Bcl-XL的产生,诱导单核细胞凋亡,阻碍单核细胞向巨噬细胞分化,最终减少炎症因子的产生。提示,FC-99可能是通过抑制单核/巨噬分化,达到缓解脓毒症引起的肝脏炎性损伤的目的,FC-99对CLP诱导的小鼠肝功能损伤具有潜在的治疗效果。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R965
【部分图文】：

血浆,小鼠

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肝损伤,脓毒症,血浆,模型小鼠

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肝组织,肝损伤,脓毒症,血浆