非昔罗霉素生物合成机制的研究

发布时间：2020-10-20 04:56

　　 非昔罗霉素(Ficellomycin)是从细绳链霉菌(Streptomyces ficellus NRRL8067)的发酵产物中分离获得的一种类二肽化合物,由一个缬氨酸和一个特殊的氨基酸(类似精氨酸)通过肽键缩合而成。非昔罗霉素能够特异性地作用于DNA半保留复制过程中形成的冈崎片段(34S),阻止其进一步拼接形成完整的染色体DNA,从而抑制细胞的分裂,但对正常细胞的生理代谢活动没有影响。近年来,非昔罗霉素以其独特的分子结构和作用机制,受到了广泛关注,但对其生物合成途径以及分子结构中一些重要官能团的催化合成机制尚缺乏系统研究。目前本课题组已经从细绳链霉菌中分离出了非昔罗霉素的生物合成基因簇,经过生物信息学分析,该基因簇大约30 kb左右,包含26个开放阅读框。其中nrps基因、谷氨酰胺鲨肌醇转氨酶基因等已经确定是非昔罗霉素生物合成所必须的基因,但仍有部分基因未确定。因此本研究通过基因阻断及回补实验对基因fic27(功能未知)、基因fic28(磺酰基转移酶)、基因sul1/sul2(腺苷酰转移酶)进行进一步研究,同时对非昔罗霉素中重要官能团氮杂环丙烷(aziridine)的生物合成机制进行了研究及分析。通过基因阻断及回补实验表明:基因fic27(功能未知)、基因fic28(磺酰基转移酶)、基因sul1/sul2(腺苷酰转移酶)均参与了非昔罗霉素的生物合成,是其生物合成所必须的基因。其中,腺苷酰转移酶基因在完整的染色体中存在两个(基因fic17/fic18和基因sul1/sul2),阻断其中一个仍能产生非昔罗霉素但产量减少,全部阻断后不能产生非昔罗霉素,证明均参与了非昔罗霉素的合成。通过对基因fic28(磺酰基转移酶)在大肠杆菌Rosseta(Escherichia coli Rosseta)的异源表达对重要官能团氮杂环丙烷的生物合成机制的研究发现,磺酸基转移酶的最适催化反应温度为37℃C且酶的稳定性较好。通过底物选择性及酶催化反应分析得出氮杂环丙烷可能先于氮杂双环中五元环形成,但需进一步验证。初步分离纯化发酵液中非昔罗霉素,进行抗菌谱分析。采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种菌株为指示菌进行生物活性检测,得出非昔罗霉素对金黄色葡萄球菌以及耐药性金黄色葡萄球菌(包括耐青霉素、耐链霉素、耐红霉素)、枯草芽孢杆菌、草酸青霉、雷斯青霉、蓝色犁头酶有抑制作用,且对金黄色葡萄球菌的抑制作用较好,初步完善了非昔罗霉素的抗菌谱。本研究验证了非昔罗霉素的生物合成基因簇中的部分基因并初步验证了磺酰基转移酶在重要官能团氮杂环丙烷生物合成机制中的重要作用,为进一步通过遗传改造提高该抗生素的产量提供了理论依据,同时为获得具有临床应用前景的结构类似物奠定了基础。
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R914
【部分图文】：

?数板进行计数，最后用２ｘＹＴ液体培养基调节孢子悬液到一定浓度备用，过滤器过滤??装置如图２－１。??：７得??Ｉ??！??图２－１孢子过滤器??Ｆｉｇ．?２－１?Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ?ｄｅｖｉｃｅ?ｏｆ?ｓｐｏｒｅｓ??１：底部已挖空的玻璃试管（Ａ?ｔｕｂｅ?ｗｉｔｈ?ａ?ｐｏｌｅ?ａｔ?ｔｈｅ?ｂｏｔｔｏｍ）?；?２：脱脂棉（Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ?ｃｏｔｔｏｎ）?；?３：??玻璃试管（Ｔｅａｔ?ｇｌａｓｓ）??２．２．４．２重组大肠杆菌ＥＴＩ２５６７菌悬液的制备??（１）

（４．６ｘ２５０?ｍｍ?），再通过布鲁克液质连用（Ｑ－ＴＯＦ）进行产物的质谱分析。??２．２．１２非昔罗霉素的分离纯化方法??参照图２－２的流程对发酵液中的非昔罗霉素进行纯化，保持ｐ｜｜?８－１０的碱性环境。??发酵液离心后经过硅藻土过滤去除残留的不溶性杂质，得到的上淸通过硅酸镁吸附柱??除去ｆｅｌｄａｍｙｃｉｎ；?Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ?ＸＡＤ－４大孔树脂柱可以除去ｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ。采用阴离子交换柱时??洗脱液为０．５?ｍｏｌ／Ｌ－２．０?ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣＩ溶液洗脱具体纯化流程如图２－２。非昔罗霉??素对紫外光只有末端吸收，故初步纯化的样品选择用Ａｇｉｌｅｎｔ?１２６０高效液相色谱（蒸??发光散射）检测样品中物质成分，使用的分析柱为Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ?ＮＦｂ?（３?｜＿ｉｍ，１５０??ｍｍ）。流动相：Ａ相是含有０．１％甲酸的水，Ｂ相是含有０．１％甲酸的乙腈，流速为??０．２?ｍＬ／ｍｉｎ。洗脱条件：０－２０?ｍｉｎ，?Ｂ?相从?８０％降至?４０％；?２卜３０?ｍｉｎ，?Ｂ?相?４０％；?３０－４０??ｍｉｎ，?Ｂ相从４〇％提高至８０％；?４０－５０?ｍｉｎ，?Ｂ相８０％。结合质谱分析对应时间物质的??质核比并进行二级质谱分析判定纯化样品为非昔罗霉素。???＾????－Ｖ??ｆｉ繼额处理稱减心?????￣￣??、，播酸沒论过夜

卜Ｔ?＼??（?ｐＫＣ１１３９－Ｍ?１??Ｃ７??图３－１重组载体的构建??Ｆｉｇ．?３－１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＫＣＩ?１３９－Ｍ??ｐＫＣｌ?１３９－Ｍ：?ｐＫＣＩ?１３９－Ｍ?Ｋ?ｐＫＣ１１３９－Ｍ２??将上述己构建好的重组载体经￡ｃ＾ＲＩ和所ｎｄｌｌ丨双酶切进行验证，酶切后通过琼??脂糖凝胶电泳验证结果如图３－２所示。通过电泳图可以看出，重组载体经过双酶切后??产生的的大片段与经过酶切线性化的质粒ｐＫＣｌ?１３９大小一致，约为６．５?ｋｂ，小ｊ＿，段１ｊ??插入片段大小…致，约为２．８?ｋｂ。将双酶切验证正确的重组载体送去测序公ｕ＇ｊ测汴，??将结果正确的重组载体命名为ｐＫＣ丨丨３９－ＭＩ，即为本实验耑要用十Ｍ源承组双交换基??因阻断的质粒。??１?２?Ｍ??Ｂｆｌ－＊?６．０?ｋｂ??—＇?３．０??图３－２?ｐＫＣｌ?１３９－ＭＩ重组载体的酶切分析??Ｆｉｇ．?３－２?Ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＫＣｌ?１３（）－Ｍ?Ｉ??Ｍ：?ｍａｋｅｒ?（Ｉ?ｋｂ）?；?Ｉ、２：?ｐＫＣｌ?
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本文编号：2848240