紫杉肽中紫杉醇含量分析研究

发布时间：2017-04-05 20:17

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【摘要】：研究目的紫杉醇是从红豆杉中提取的抗肿瘤药物,水溶性较差。紫杉肽是紫杉醇的聚合衍生物,是在紫杉醇C13侧链的2’位上通过酯键与多肽聚合而成,分子量在10～40kDa范围内。紫杉肽表现出良好的水溶性和抗肿瘤活性。紫杉肽中紫杉醇含量分析方法的建立对紫杉肽研发具有重要意义,虽然可以通过紫杉肽制备过程中的投料量确定紫杉醇理论含量,但是,紫杉肽的分子量不均一且结构复杂,难以对其中紫杉醇的含量进行准确测定,未见国内文献报道利用色谱法测定紫杉肽中紫杉醇含量。本研究旨在建立紫杉肽中紫杉醇含量的体内、外分析方法,为紫杉肽的药学资料研究、毒理学、药理学研究和临床研究中的含量分析提供参考依据。研究方法在紫杉肽中包括与多肽链结合的结合型紫杉醇和未与多肽链结合的游离型紫杉醇。首先,建立游离紫杉醇的含量分析方法,紫杉肽经液-液萃取法萃取其中游离紫杉醇后,通过HPLC法检测分析；分别通过不同种类蛋白酶和不同pH溶液水解连接紫杉醇和多肽链的酯键,以液-液萃取法萃取其中紫杉醇后,HPLC法检测分析,通过与紫杉肽中紫杉醇理论含量比较,初步确定水解反应的效率；通过对紫杉肽在不同溶液中水解规律的研究,发现紫杉肽及紫杉醇在pH13.0溶液中极不稳定,将反应后溶液分离、纯化后,得到紫杉醇的单一水解产物,通过对紫杉醇稳定且特有的水解产物的鉴定和检测分析,间接对紫杉肽中紫杉醇含量进行测定。研究结果1.紫杉肽中游离紫杉醇含量测定及方法学确证。紫杉肽中游离紫杉醇以乙醚萃取后,参考《中华人民共和国药典》二部(2010版)紫杉醇注射制剂含量分析方法,建立了紫杉醇HPLC分析方法,采用Thermo Hypersil GOLD (4.6×150 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈：水(50：50,v/v),检测波长为227 nm。实验结果表明,该方法专属性、重复性和稳定性良好,简单、易操作,适用于紫杉醇的含量分析研究。测得5个批次紫杉肽中,每瓶含游离紫杉醇的量在21.6～79.2μg范围内。2.紫杉肽中结合型紫杉醇解离实验。紫杉肽分别经枯草杆菌蛋白酶、嗜热杆菌蛋白酶和pH 1.9～13.0溶液水解处理后,以乙醚萃取其中紫杉醇并检测分析,通过与紫杉肽中紫杉醇理论含量比较,计算水解比率。结果表明,不同溶液中紫杉肽的水解比率各不相同：紫杉肽经嗜热杆菌蛋白酶处理后,测得酶解率为10.57%,紫杉肽经枯草杆菌蛋白酶处理后,测得酶解率为12.49%；紫杉肽经pH 9.2溶液处理后,测得紫杉醇量最高,约占紫杉醇理论含量的23.29%。两种方法测得结果均与紫杉肽中紫杉醇理论含量相差较多,可能原因有紫杉醇在处理条件下不稳定和处理过程不彻底。因此,以上两种方法未能将紫杉肽中的紫杉醇稳定可控的解离,从而实现紫杉肽中紫杉醇含量分析的目的。当以pH为13.0溶液溶解紫杉肽后,未检测到紫杉醇,说明紫杉醇在该条件下极不稳定。3.紫杉肽和紫杉醇碱性条件下水解产物分析。通过紫杉肽在不同溶液中水解过称研究发现,紫杉醇和紫杉肽在pH13.0条件下易水解,生成一系列化合物,通过液相色谱方法对紫杉醇的系列水解产物分离纯化,制备了约5.7 mg单一水解产物。通过质谱和1H NMR初步推断其结构,在购得相应标准品后,通过UPLC、UV和MRM等方法对其结构进行了确证,最终确定该水解产物为紫杉醇母核13’位上侧链的羧酸钠。分子式为：C16H14NNaO4;分子量为：307.08。4.紫杉肽中紫杉醇含量测定及方法学确证。紫杉肽和紫杉醇经0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液水解后,以Agilent 1290 UPLC检测分析,采用Waters BEH C18 (2.1× 50 mm,1.7μm)色谱柱,流动相为乙腈：水(10：90,v/v),检测波长为227 nm。紫杉醇标准品经水解后,与相同物质的量浓度的紫杉醇C13侧链标准品比较,结果测得峰面积之比与理论值的偏差为-0.70%,说明紫杉醇的水解反应是彻底的；分析方法准确、重现性好,满足药典规定药物含量测定方法学要求。测得5个批次紫杉肽中,每瓶中紫杉醇含量在31.80～37.38mg范围内。5.血浆样品中紫杉肽分析方法的建立及方法学确证。紫杉肽样品和紫杉醇溶液与人血浆混合后,用0.2 mol·L-1氢氧化钠水解处理,再以两倍体积乙腈除去样品中的蛋白质后,通过UPLC-MS/MS法检测分析。通过对紫杉醇与紫杉肽共有的水解产物的测定,实现了对血浆样品中紫杉肽的紫杉醇含量准确测定的目的。结果表明,该方法水解反应稳定彻底,灵敏度高,专属性、重复性和稳定性良好,测得5个批次紫杉肽中,每瓶中紫杉醇含量在31.85～37.54 mg范围内。研究结论本研究所建立的紫杉肽中游离型紫杉醇和结合型紫杉醇含量测定方法简单易行,且分析结果准确可靠,对紫杉肽的含量分析有一定参考意义,对同类紫杉醇的改进剂型的分析有一定的借鉴意义。
【关键词】：紫杉醇 紫杉肽 定量分析 产物鉴定
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R917
【目录】：

• 个人简历3-7
• 中英文缩略词汇表7-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-18
• 第一章 紫杉肽中游离紫杉醇含量测定及方法学确证18-27
• 1 实验目的18
• 2 实验材料18-19
• 2.1 药品和试剂18
• 2.2 仪器18-19
• 3 实验部分19-20
• 3.1 溶液制备19
• 3.2 紫杉醇标准曲线及质控样品的制备19-20
• 3.3 紫杉肽样品处理20
• 3.4 HPLC检测条件20
• 3.5 数据统计和处理20
• 4 实验结果20-24
• 4.1 方法学确证20-24
• 4.2 紫杉肽样品测定24
• 5 讨论24-25
• 6 结论25-27
• 第二章 紫杉肽中结合型紫杉醇解离实验27-35
• 1 实验目的27
• 2 实验材料27-28
• 2.1 药品和试剂27
• 2.2 仪器27-28
• 3 实验方法28-31
• 3.1 紫杉肽中结合型紫杉醇蛋白酶解离实验28-29
• 3.2 紫杉肽中结合型紫杉醇酸碱解离实验29-30
• 3.3 HPLC检测条件30-31
• 3.4 数据统计和处理31
• 4 实验结果31-33
• 4.1 紫杉肽中结合型紫杉醇蛋白酶解离实验31
• 4.2 紫杉肽中结合型紫杉醇酸碱解离实验31-33
• 5 讨论33
• 6 结论33-35
• 第三章 紫杉肽和紫杉醇碱性条件下水解产物分析35-46
• 1 实验目的35
• 2 实验材料35-36
• 2.1 药品和试剂35
• 2.2 仪器35-36
• 3 实验部分36-44
• 3.1 溶液配制36
• 3.2 紫杉醇及紫杉肽水解产物的分离纯化36-40
• 3.3 水解产物质谱和核磁共振氢谱分析40-41
• 3.4 水解产物结构推断41
• 3.5 水解产物结构的确证41-44
• 4 讨论44-45
• 5 结论45-46
• 第四章 紫杉肽中紫杉醇含量测定及方法学确证46-58
• 1 实验目的46
• 2 实验材料46-47
• 2.1 药品和试剂46
• 2.2 仪器46-47
• 3 实验部分47-49
• 3.1 溶液制备47
• 3.2 紫杉醇标准曲线的制备47-48
• 3.3 紫杉肽样品处理48
• 3.4 UPLC检测条件48-49
• 3.5 数据统计和处理49
• 4 实验结果49-56
• 4.1 紫杉醇水解效率考察49-50
• 4.2 方法学考察50-56
• 4.3 紫杉肽样品测定56
• 5 讨论56-57
• 6 结论57-58
• 第五章 血浆样品中紫杉肽分析方法的建立及确证58-73
• 1 实验目的58
• 2 实验材料58-59
• 2.1 药品和试剂58
• 2.2 仪器58-59
• 3 实验部分59-61
• 3.1 溶液制备59
• 3.2 紫杉醇标准曲线及质控样品的制备59-60
• 3.3 紫杉肽样品处理60
• 3.4 UPLC-MS/MS检测条件60-61
• 3.5 数据统计和处理61
• 4 实验结果61-69
• 4.1 紫杉醇及紫杉肽水解反应考察61-64
• 4.2 方法学确证64-69
• 4.3 紫杉肽样品测定69
• 5 讨论69-71
• 6 结论71-73
• 总结73-75
• 参考文献75-79
• 综述79-89
• 参考文献84-89
• 致谢89-90
• 攻读硕士期间发表的学位论文90-93

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本文编号：287641