基于兔VX2原位肺癌模型的多西他赛脂质体药效学研究

发布时间：2020-11-12 22:20

　　 背景本文以临床治疗非小细胞肺癌的多西他赛注射液(DTX-IN)缺乏肺靶向性、DTX用药量较大以及注射液中增溶剂聚山梨酯80容易引起过敏等毒副反应为切入点,采用自主创建的固体分散和水化泡腾技术,设计并制备的新型多西他赛脂质体(DTX-LP),不仅极大降低了聚山梨酯80的使用量,而且具有高度肺靶向性、能将约90%的DTX传递至肺部及其肿瘤组织,从而提高抗肺癌效果且降低毒副作用。目的本文基于兔VX2原位肺癌模型,从抗肺癌药效学实验、药物组织分布、药代动力学行为、药物体内代谢等方面,考察设计制备的DTX-LP是否达到了提高疗效而降低毒副作用的目的。方法1.兔VX2原位肺癌模型的建立。采用微创胸腔穿刺术制作兔VX2原位肺癌模型(以下简称模型兔),以CT、大体解剖和HE染色等方法,确证模型是否建立成功,计算模型接种成功率,观察其生存状态以及肺癌的生长情况。2.基于兔VX2原位肺癌模型进行DTX-LP抗肺癌药效学实验。将模型兔随机分为对照组、DTX-IN组、DTX-LP低剂量组和DTX-LP高剂量组,分别给予生理盐水、DTX-IN(1.0 mg/kg)、DTX-LP(0.5 mg/kg)、DTX-LP(1.0 mg/kg),每周一次,连续六周。以抑瘤率、凋亡率、增殖率、微血管生成情况、生存期、HE病理切片和自身体重变化等为指标,考察DTX-LP在兔VX2原位肺癌模型上的抗肺癌药效。3.基于兔VX2原位肺癌模型进行DTX-LP的组织分布和药代动力学研究。将模型兔随机分为DTX-IN组和DTX-LP组,分别给予同等剂量(1.0 mg/kg)的DTX-IN和DTX-LP。采用HPLC-UV方法,测定给药后0.5h、1.5h、4h、8h和24h等时间点的心、肝、脾、肺、肾、胃、脑和肿瘤等组织中DTX的分布情况;采用UPLC-MS/MS方法,测定给药后5min、15min、30min、1h、1.5h、2h、4h和8h等时间点的血浆药物浓度,计算其药代动力学参数。4.基于兔VX2原位肺癌模型进行DTX-LP体内代谢研究。将模型兔随机分为DTX-IN组和DTX-LP组,分别给予同等剂量(2.0 mg/kg)的DTX-IN和DTX-LP。收集各组的肺组织、肝组织、胆汁以及粪便。采用UPLC-MS/MS方法,测定DTX及其代谢物。结果1.成功建立了兔VX2原位肺癌模型。采用微创胸腔穿刺术成功实现了快速、批量制作兔VX2原位肺癌模型。该方法具有接种快(一例约15min)、成功率高(100%)以及接种部位准确(右肺中部)等优点。接种两周后,CT观察到右肺中部有直径2-10mm结节;组织HE染色显示肿瘤结节细胞浸润生长,肿瘤细胞异型性明显。模型兔平均生存周期为42.0±10.8天,肿瘤倍增时间为5.19±0.81天。2.成功进行了基于兔VX2原位肺癌模型的DTX-LP抗肺癌药效学实验。与同等剂量(1.0 mg/kg)的DTX-IN比较,DTX-LP制剂具有显著提高疗效、降低毒副作用以及延长生存时间近一倍等优点。经6周治疗实验显示:(1)同等剂量下的DTX-IN和DTX-LP组CT抑瘤率分别为84.39%和94.71%(P0.01),这表明DTX-LP提高疗效显著;(2)在对照组、DTX-IN组、DTX-LP低剂量组和DTX-LP高剂量组中,采用FCM测得的凋亡率分别为29.64%±3.80%、43.23%±2.13%、44.15%±4.76%和68.75%±5.90%(其中DTX-IN组和DTX-LP高剂量组之间P0.01),采用TUNEL测得凋亡指数分别为7.9%±1.0%、11.7%±1.1%、11.6%±0.7%、13.9%±0.9%(其中DTX-IN组和DTX-LP高剂量组之间p0.01),PCNA测得增殖指数分别为41.7%±8.2%、21.1%±3.4%、23.1%±2.1%、15.6%±2.7%(其中DTX-IN组和DTX-LP高剂量组之间P0.05),这些测定数据都表明DTX-LP高剂量组能显著增加肿瘤组织的凋亡;(3)免疫组织化学CD31实验证实,DTX-LP高剂量组明显减少肿瘤新生血管生成;(4)大体解剖实验显示,DTX-LP高剂量组能减少肿瘤肺部扩散和胸腔转移;(5)各组织的病理切片结果显示,DTX-IN对模型兔非靶组织(如心、肝、脾、肾等)有较为明显的病理改变,而同等剂量的DTX-LP则无明显改变,这表明DTX-LP基本对心、肝、脾和肾等非靶组织基本无毒副作用;(6)在对照组、DTX-IN组、DTX-LP低剂量组和DTX-LP高剂量组中,自身体重的平均下降率分别为32.6%、25.2%、17.9%和15.6%,这表明DTX-LP组对自身体重下降情况有明显改善;而平均生存的时间(天)分别为41.0±11.1、56.0±11.9、60.5±14.0和92.3±21.8(其中DTX-IN组和DTX-LP高剂量组之间P0.05),这表明DTX-LP高剂量组可延长生存时间近一倍。3.成功进行了基于兔VX2原位肺癌模型的组织分布和药代动力学研究。经实验显示,给予DTX-LP后30min、1.5h、4h、8h和12h等不同时间点肺部的DTX浓度(μg/g)分别为76.97±3.99、50.45±5.46、39.87±3.89、39.42±8.52和28.03±4.10;肿瘤组织中DTX的浓度(μg/g)分别为57.31±9.30、48.48±4.21、33.80±2.23、32.05±2.37和28.93±2.01,这些数据都相应明显高于DTX-IN组,如1.5h兔肺部和肿瘤组织中DTX的浓度是DTX-IN的10.2倍和5.8倍;非靶组织(如肝、脾、肾等)中DTX的浓度明显降低,提示DTX在这些组织基本无毒副作用,这与病理切片结果一致;而给予DTX-LP后各时间点的血药浓度都相应低于DTX-IN组,血浆C_(max)、t_(1/2)、AUC_(0→t)分别为DTX-IN组的0.86倍、0.44倍和0.37倍(P0.05)。这就表明DTX-LP进入体内后快速由血液分布到肺部及其肺癌组织中。4.成功进行了基于兔VX2原位肺癌模型的体内代谢研究。经模型兔实验发现,在DTX-IN组和DTX-LP组中粪便的代谢物基本一致,都含有原药DTX(M)及其已知代谢产物四种(即M-1/3、M-2和M-4)。另外,从MS的离子丰度显示,DTX-IN组中代谢物的浓度在8-24h时间段达到峰浓度,而DTX-LP组中代谢物的浓度则在24-48h时间段达到峰浓度。这就提示,DTX被包裹成脂质体后,DTX代谢途径并未改变,只是延迟了DTX的代谢转化时间。结论综上所述,本文成功进行了基于兔VX2原位肺癌模型的DTX-LP药效学研究。与DTX-IN相比,设计制备的DTX-LP未改变DTX代谢途径而只是延迟了DTX的代谢转化时间,并且具有显著提高疗效、降低毒副作用以及延长生存时间近一倍等优点。为此,可以认为设计制备的DTX-LP达到了提高疗效而降低毒副作用的目的。这就意味着具有高效低毒的DTX-LP是一种非常具有临床应用前景的靶向制剂。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

17图 1-1 透视条件下的胸腔微创穿刺术建立兔 VX2 原位肺癌模型过程A.固定、消毒、铺巾；B.穿刺针体外透视定位；C.穿刺针刺入兔右肺；D.穿刺针体内透视定位；E.拔出穿刺针，手术结束；F.兔苏醒Fig.1-1 The procedure of minimal invasive percutaneous puncture inoculation to establishVX2 orthotopic lung cancer rabbits model (A) fixed on the digital gastrointestinal machine; (Bposition in vitro; (C) percutaneous puncture inoculation; (D)position in vivo; (E) withdrawingthe needle; (F) wake up after inoculation

21图 1-3 模型兔肺部大体解剖观察（黑色箭头表示肿瘤结节）种后 3 周后肺组织；B. 接种后 6 周后肺组织；C.自然死亡后肺组织；D. 自然死亡肿瘤胸壁、气管、胸膜等多处转移1-3 the probable tumors confirmed by necropsy (the black or white arrows indicatedntrapulmonary tumors) A.Lungs at 3 weeks post inoculation; B.Lungs at 6 weeks poinoculation; C.Lungs after nature death; D. pleural metastases图 1-3 显示，接种第 3 周时，肉眼观察到模型兔右肺 VX2 移植瘤结节为呈现右肺单一生长，边缘清晰，无包膜，质地较硬，切面呈实质性，灰样；接种 6 周后，肿瘤结节不仅体积增大，而且出现肺单侧转移，散在转移瘤，呈现弥漫生长状态，部分融合成片状，表面呈鱼肉样。随后肿一步扩散，高度浸润性生长，并呈现双肺、胸壁、气管和支气管、胸膜

23图 1-4 VX2 肿瘤结节组织病理学检查（HE 染色）A.接种 3 周（200×）；B.接种 3 周（400×）；C.接种 6 周（200×）；D.接种 6 周（400×）；E.自然死亡后（200×）；F. 自然死亡后（400×）Fig.1-4 The histological view of VX2 lung tumor (HE staining)A.three weeks post-incubation (200×); B.three weeks post-incubation (400×); C.six weekspost-incubation (200×); D.six weeks post-incubation (400×); E.after nature death (200×);F.after nature death (400×)图 1-4 显示，HE 染色切片显示肿瘤结节细胞为低分化鳞癌，低倍镜下，肿瘤细胞紧密呈实体巢状，大小不等，且癌巢向周围组织浸润生长，高倍镜下肿瘤细
【参考文献】

相关期刊论文 前7条

1 李美波;顾生玖;赵文鹏;朱开梅;;紫杉醇长循环热敏脂质体对Lewis肺癌荷瘤鼠的药效学研究[J];实用医学杂志;2014年14期

2 王世江;王佩国;霍志军;孙新东;王平;于金明;;兔VX2肺癌模型多层螺旋CT灌注扫描与肿瘤乏氧显像相关性研究[J];中华肿瘤防治杂志;2014年10期

3 Atsushi Nanashima;Toshiyuki Nakayama;Yorihisa Sumida;Takafumi Abo;Hiroaki Takeshita;Kenichirou Shibata;Shigekazu Hidaka;Terumitsu Sawai;Toru Yasutake;Takeshi Nagayasu;;Relationship between microvessel count and post-hepatectomy survival in patients with hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2008年31期

4 鲁植艳,夏东,刘绚,刘骏方,陈洪雷,刘铭球;改良型大鼠肺鳞癌发展模型的建立[J];武汉大学学报(医学版);2003年03期

5 ;烹调油烟诱发小鼠肺癌的实验研究[J];癌变.畸变.突变;2001年04期

6 李哲，王玉民，郭红梅，候天慧，周慧;多环芳烃诱发实验动物肺癌模型[J];山西医药杂志;1994年04期

7 金春林,王锦福,郑树忠;生存分析Kaplan—meier法简介[J];卫生软科学;1994年06期

本文编号：2881309