特异性测定赖氨酸去甲基化酶活性的方法及其在抑制剂筛选中的应用

发布时间：2020-12-20 11:28

　　肿瘤是当前人类面临的一大医学疾病。近几十年来表观遗传学围绕基因异常表达引起的肿瘤发生,获得了许多重要的突破,其中组蛋白翻译后修饰(PTM)是当前世界范围内研究的热点。组蛋白赖氨酸残基的第五位氨基(N~ε)常常发生不同类型的PTM包括乙酰化、磷酸化、泛素化和甲基化等。其中,组蛋白赖氨酸的异常甲基化与肿瘤细胞的转化、异常增殖有着密切的联系。组蛋白赖氨酸甲基化的修饰受到两类具有相反功能的酶调节:组蛋白赖氨酸甲基转移酶(KMTs)和组蛋白赖氨酸去甲基化酶(KDMs)。近年来,KDMs在不同肿瘤的发生发展过程中扮演着越来越重要的作用,如促进原癌基因的表达激活,免疫系统失调,DNA损伤修复等。因此找出有效的抑制剂是治疗KDMs表达异常的癌症的关键所在。迄今为止,几种不同的高通量筛选(HTS)方法已经被开发用于寻找KDMs的抑制剂。但是假阴性、假阳性和无法实时监测酶活性是这几种方法的主要弊端,所以迫切需要一种更加优化的检测KDMs活性的方法。鉴于上述现有技术的不足,本研究针对KDMs,利用核磁共振技术开创了一套新颖而特异性的检测酶活性和筛选抑制剂的方法。首先在较复杂的环境如细胞裂解液,可以高选择性、... 

【文章来源】：深圳大学广东省

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

由含有JmjC结构域的KDMs介导的组蛋白赖氨酸去甲基化反应机制

特异性测定赖氨酸去甲基化酶活性的方法及其在抑制剂筛选中的应用21图3.核磁共振波谱检测缓冲液体系KDM4A介导的代谢反应。（A）组蛋白去甲基化酶KDM4A不存在时缓冲液中的底物α-KG，（B）和产物SUC的HCACONMR核磁共振谱；（C、D），添加纯化的KDM4A时缓冲液中的底物α-KG（C）和产物SUC（D）的HCACONMR核磁共振谱。每个实验缓冲液中都含有酸提取的组蛋白，13C标记的α-KG（0.1mg），Ascorbicacid（1mM）和(NH4)2Fe(SO4)2（50μM）。

特异性测定赖氨酸去甲基化酶活性的方法及其在抑制剂筛选中的应用23图4.核磁共振波谱检测细胞裂解液中KDM4A介导的代谢反应。（A）在细胞裂解液中，产物SUC的常规1HNMR检测，显示出SUC的1H信号与来自内源分子的背景信号重叠。（B）产物SUC的HCACONMR核磁共振谱，其中被13C标记的1H-13CA-13CO已用红色标记出来。每个实验缓冲液中都含有13C标记的α-KG（0.1mg），Ascorbicacid（1mM）和(NH4)2Fe(SO4)2（50μM）。


本文编号：2927786