尼帕病毒进入抑制剂体外药效学评价模型的建立
发布时间：2020-12-23 04:12
目的:尼帕病毒（Nipah virus,NiV）是高致死性的人畜共患病病毒,属生物安全4级病原（BSL-4）,其主要疫区在东南亚,迄今尚无疫苗或治疗药物。本研究旨在建立安全、特异、高效的尼帕病毒进入抑制剂体外药效学评价模型。方法:采用假病毒技术,以尼帕病毒表面糖蛋白G和融合蛋白F包裹HIV-luc核心构建尼帕假病毒,用于感染尼帕病毒受体ephrin-B2高表达的HEK293T细胞,建立并优化药效学评价模型。结果:成功建立了可用于尼帕病毒进入抑制剂活性评价的NiV-G-F/HIV-luc感染模型,经工具药验证(NiV-F-HR2融合肽,EC50:0. 12μmol·L-1)模型可用于化合物抗尼帕病毒药效学评价。结论:本研究构建的尼帕病毒进入抑制剂药效学评价模型特异性好、安全性高,可为抗尼帕病毒疫苗和药物活性评价提供技术平台,对抗尼帕病毒药物的研发有重要意义。
【文章来源】：中国新药杂志. 2020年08期 北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
用于构建尼帕假病毒感染模型的质粒
尼帕病毒以pH非依赖方式进入宿主细胞，病毒表面糖蛋白G、融合蛋白F和宿主细胞表面ephrin-B2参与此过程[20]。在构建Ni V-F和Ni V-G包裹HIV-luc核心假病毒时，细胞正确、高效表达病毒表面糖蛋白G及融合蛋白F是病毒包装的前提，因此本研究首先对此进行了检测。结果显示，细胞转染Ni V-G质粒后，细胞中可检测到Ni V-G，其大小约为72～75 kD，与野生病毒Ni V-G一致[25]，表明该蛋白已正确表达且被有效糖基化(见图3A);细胞转染Ni V-F质粒后，细胞中可检测到融合前体蛋白F0(～61 k D，见图3A)及融合蛋白F1亚基(～49 k D，见图3A)，与文献报道一致[15,26]。Ephrin-B2是Ni V功能受体，细胞表面ephrin-B2高水平表达有利于Ni V的感染。因此，本研究构建了高表达ephrin-B2的HEK293T细胞，并比较了HEK293T/ephrin-B2与野生型HEK293T细胞中ephrin-B2的表达水平。结果显示，HEK293T转染pIRES2/ephrin-B2质粒后，细胞中ephrin-B2表达水平显著提高(见图3B)。1.3构建尼帕假病毒感染模型
Ni V为单股负链RNA病毒，病毒颗粒呈多形性，直径为40～1 900 nm[1,18]。病毒基因组全长18.2 kb，共编码9个蛋白(L,G,F,M,P,N,V,W和C)。Ni V以p H非依赖方式进入宿主细胞[1-2]，嵌在病毒膜上的糖蛋白(glycoprotein,G，见图1A)和融合蛋白(fusion protein,F，见图1C)参与了此过程，宿主细胞表面的ephrin-B2是Ni V功能受体[1]。Ni V-G由602个氨基酸编码组成，包含7个N糖基化位点，其疏水性结构域的9个氨基酸(L305,F458,W504,E505,Q530,T531,A532,E533,N557，见图1B红色)是与ephrin-B2结合的关键氨基酸残基[1]。Ni V-F蛋白是含有546个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，由二硫键连接的F2和F1(包含疏水性融合肽、HR1、HR2、跨膜区和胞质区)2个活性亚基组成(见图1C和1D)，在病毒表面以三聚体形式存在[19-20]。融合蛋白F0是无活性的前体蛋白，在被感染细胞中F0被合成后经内质网、高尔基体转运至细胞膜，随后在网格蛋白介导下内化，经内体组织蛋白酶L或组织蛋白酶B切割，生成具有融合活性的F2和F1亚基并运至细胞膜外，其中F1亚基在病毒融合过程中发挥重要作用。尼帕病毒进入宿主是病毒感染的第一步，阻断病毒的进入可有效抑制病毒感染。
【参考文献】：
期刊论文
[1]沙粒病毒进入抑制剂体外药效学评价模型的建立[J]. 张晓雨,唐克,郭家梅,陈勍,郭颖. 药学学报. 2018(05)
[2]尼帕病毒进入抑制剂研究进展[J]. 唐克,郭颖. 病毒学报. 2017(05)
[3]丝状病毒进入抑制剂的细胞水平评价体系的建立[J]. 陈勍,郭颖. 药学学报. 2015(12)
本文编号：2933048
【文章来源】：中国新药杂志. 2020年08期 北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
用于构建尼帕假病毒感染模型的质粒
尼帕病毒以pH非依赖方式进入宿主细胞，病毒表面糖蛋白G、融合蛋白F和宿主细胞表面ephrin-B2参与此过程[20]。在构建Ni V-F和Ni V-G包裹HIV-luc核心假病毒时，细胞正确、高效表达病毒表面糖蛋白G及融合蛋白F是病毒包装的前提，因此本研究首先对此进行了检测。结果显示，细胞转染Ni V-G质粒后，细胞中可检测到Ni V-G，其大小约为72～75 kD，与野生病毒Ni V-G一致[25]，表明该蛋白已正确表达且被有效糖基化(见图3A);细胞转染Ni V-F质粒后，细胞中可检测到融合前体蛋白F0(～61 k D，见图3A)及融合蛋白F1亚基(～49 k D，见图3A)，与文献报道一致[15,26]。Ephrin-B2是Ni V功能受体，细胞表面ephrin-B2高水平表达有利于Ni V的感染。因此，本研究构建了高表达ephrin-B2的HEK293T细胞，并比较了HEK293T/ephrin-B2与野生型HEK293T细胞中ephrin-B2的表达水平。结果显示，HEK293T转染pIRES2/ephrin-B2质粒后，细胞中ephrin-B2表达水平显著提高(见图3B)。1.3构建尼帕假病毒感染模型
Ni V为单股负链RNA病毒，病毒颗粒呈多形性，直径为40～1 900 nm[1,18]。病毒基因组全长18.2 kb，共编码9个蛋白(L,G,F,M,P,N,V,W和C)。Ni V以p H非依赖方式进入宿主细胞[1-2]，嵌在病毒膜上的糖蛋白(glycoprotein,G，见图1A)和融合蛋白(fusion protein,F，见图1C)参与了此过程，宿主细胞表面的ephrin-B2是Ni V功能受体[1]。Ni V-G由602个氨基酸编码组成，包含7个N糖基化位点，其疏水性结构域的9个氨基酸(L305,F458,W504,E505,Q530,T531,A532,E533,N557，见图1B红色)是与ephrin-B2结合的关键氨基酸残基[1]。Ni V-F蛋白是含有546个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，由二硫键连接的F2和F1(包含疏水性融合肽、HR1、HR2、跨膜区和胞质区)2个活性亚基组成(见图1C和1D)，在病毒表面以三聚体形式存在[19-20]。融合蛋白F0是无活性的前体蛋白，在被感染细胞中F0被合成后经内质网、高尔基体转运至细胞膜，随后在网格蛋白介导下内化，经内体组织蛋白酶L或组织蛋白酶B切割，生成具有融合活性的F2和F1亚基并运至细胞膜外，其中F1亚基在病毒融合过程中发挥重要作用。尼帕病毒进入宿主是病毒感染的第一步，阻断病毒的进入可有效抑制病毒感染。
【参考文献】：
期刊论文
[1]沙粒病毒进入抑制剂体外药效学评价模型的建立[J]. 张晓雨,唐克,郭家梅,陈勍,郭颖. 药学学报. 2018(05)
[2]尼帕病毒进入抑制剂研究进展[J]. 唐克,郭颖. 病毒学报. 2017(05)
[3]丝状病毒进入抑制剂的细胞水平评价体系的建立[J]. 陈勍,郭颖. 药学学报. 2015(12)
本文编号：2933048
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