合成编码非天然氨基酸技术在蛋白质和多肽类药物长效化改造中的应用
发布时间：2020-12-24 14:50
与传统化学药物相比,蛋白质和多肽药物具有更高的安全性和靶点特异性,但其开发应用仍然存在众多挑战,其中最重要原因之一就是蛋白质和多肽药物的体内半衰期普遍偏短。为了克服上述问题,研究人员逐渐发展出多种蛋白长效化技术,通过改变药物分子的结构来影响其体内代谢速率及方式,进而延长蛋白质和多肽类药物的半衰期。相比糖基化修饰,融合蛋白修饰或PEG修饰,脂肪酸修饰不仅能实现半衰期的延长,还有助于提高药物的脂溶性、肠道黏膜透过及吸收效率,故而越来越受到研究人员的关注。传统的蛋白药物脂肪酸修饰主要通过体外化学偶联的方式来实现,存在反应条件限制多、修饰效率偏低、分离步骤复杂、修饰均一度差等多种局限。合成编码技术利用正交氨酰tRNA合成酶可以在表达宿主体内将修饰后的氨基酸（非天然氨基酸）点特异的引入到蛋白的特定位点,生产修饰蛋白,从而从原理上避开蛋白体外修饰的各种限制。本论文中,我们设计了一种带7个碳原子脂肪酸链的非天然氨基酸-HepoK,通过高通量筛选获得了一个对HepoK特异的正交氨酰tRNA合成酶;然后利用合成编码非天然氨基酸技术,在E.coli体内分别将HepoK引入到到肌红蛋白（Myoglobin）...
【文章来源】：浙江理工大学浙江省
【文章页数】：118 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
传感器放置位置
图 2.3 传感器放置位置Figure 2.3 Sensor placement location；31.5/15.75/7.88/3.94 μM 五个浓度点，按下表 2-40 上肽（PCS）、LIT-HepoK（LIT1）、LIT-WT（LIT2）和表 2-40 上样Table 2-40 Sample loading列 4 列 5 列 6 列 7 列 8 列） PBST PBST PBST PBST PBST PB PBST 3.94 μM 7.88 μM 15.75 μM 31.5 μM 63 ） PBST 3.94 μM 7.88 μM 15.75 μM 31.5 μM 63 ） PBST 3.94 μM 7.88 μM 15.75 μM 31.5 μM 63 定检测程序，并执行；
图 3.1 不同浓度 NaOH 对 DH10B 菌的生长抑制作用igure 3.1 Inhibitory effects of different concentrations of NaOH on growth of DH10B bacteria DH10B（pREP）电转感受态的转化效率取 0.1 ng pUC19 电转到制备好的 100 ul DH10B（pREP）电转感受态中，加入 900热的 SOC 培养基（此时已稀释 10 倍），振荡培养 1.5 h 后，培养物稀释后涂板，置于 37 养箱培养过夜。结果在培养物稀释 10000 的平板上长出了 582 个单克隆。根据转化效计算公式：Efficiency=(cfu on plate/ng DNA)(1*103ng/ug)*Dilution factor，可得出，这H10B 电转感受态的转化效率为 5.82*1010。而本次实验的 RS 筛选实验中，所用的 TK库的库容为 2*106，需要 DH10B（pREP）的转化效率至少是 10 倍的库容大小。因此批制备的 DH10B 电转感受态是完全能满足之后的 RS 筛选实验的。
本文编号：2935845
【文章来源】：浙江理工大学浙江省
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图 2.3 传感器放置位置Figure 2.3 Sensor placement location；31.5/15.75/7.88/3.94 μM 五个浓度点，按下表 2-40 上肽（PCS）、LIT-HepoK（LIT1）、LIT-WT（LIT2）和表 2-40 上样Table 2-40 Sample loading列 4 列 5 列 6 列 7 列 8 列） PBST PBST PBST PBST PBST PB PBST 3.94 μM 7.88 μM 15.75 μM 31.5 μM 63 ） PBST 3.94 μM 7.88 μM 15.75 μM 31.5 μM 63 ） PBST 3.94 μM 7.88 μM 15.75 μM 31.5 μM 63 定检测程序，并执行；
图 3.1 不同浓度 NaOH 对 DH10B 菌的生长抑制作用igure 3.1 Inhibitory effects of different concentrations of NaOH on growth of DH10B bacteria DH10B（pREP）电转感受态的转化效率取 0.1 ng pUC19 电转到制备好的 100 ul DH10B（pREP）电转感受态中，加入 900热的 SOC 培养基（此时已稀释 10 倍），振荡培养 1.5 h 后，培养物稀释后涂板，置于 37 养箱培养过夜。结果在培养物稀释 10000 的平板上长出了 582 个单克隆。根据转化效计算公式：Efficiency=(cfu on plate/ng DNA)(1*103ng/ug)*Dilution factor，可得出，这H10B 电转感受态的转化效率为 5.82*1010。而本次实验的 RS 筛选实验中，所用的 TK库的库容为 2*106，需要 DH10B（pREP）的转化效率至少是 10 倍的库容大小。因此批制备的 DH10B 电转感受态是完全能满足之后的 RS 筛选实验的。
本文编号：2935845
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