miR-20a对AA大鼠模型滑膜细胞中NLRP3炎症小体的调控作用及其机制的研究
发布时间：2021-01-01 03:48
类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种发病机制未明的,以滑膜炎症和关节结构破坏为特征的异质性、系统性、自身免疫性疾病。研究表明成纤维样滑膜细胞（FLS）在RA的发生发展中起着至关重要的作用,FLS异常增殖和侵袭,并形成血管翳,最终导致了关节和软骨的破坏。IL-1β被认为是重要的致FLS活化的炎症因子。NLRP3为模式识别受体NOD样受体（NLR）家族中一员,其构成的NLRP3炎症小体能够活化Caspase-1,促进IL-1β的成熟和释放。硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）作为一种氧化还原调节器,在ROS激活NLRP3炎症小体的途径中扮演重要角色,但具体调控机制未明。近年来的研究显示microRNAs参与基因转录后水平调控,广泛参与到细胞增殖、分化、凋亡等一系列重要的生物学进程,并且在炎症的发生发展中起到调控作用。miR-20a属于MicroRNA1792家族,其在RA中异常表达,且在巨噬细胞介导的炎症反应中发挥调节作用。mi R-20a是否对NLRP3介导的IL-1β释放具有调控作用,目前尚未见文献报道。本研究观察NLRP3、TX...
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
英文缩略词
中文摘要
Abstract
1 前言
2 实验材料
2.1 动物
2.2 试剂
2.3 主要仪器
2.4 溶液和试剂的配制
3. 实验方法
3.1 佐剂性关节炎（AA）大鼠模型的建立
3.2 佐剂性关节炎模型的确立
3.2.1 继发性足肿胀的测定
3.2.2 多发性关节炎指数（polyarthritis index, PI）评分
3.2.3 脾及胸腺指数
3.2.4 病理组织学检测
3.2.5 血清样本采集
3.3 大鼠滑膜细胞的分离与培养
3.3.1 大鼠滑膜组织的采集
3.3.2 大鼠滑膜细胞的分离
3.3.3 大鼠滑膜细胞的培养
3.4 MTT比色法测细胞增殖
3.5 脂质体瞬时转染NLRP3-siRNA、TXNIP-siRNA、mi R-20amimics进入FLS
3.6 qRT-PCR
3.6.1 细胞总RNA的提取
3.6.2 第一链cDNA的合成
3.6.3 qRT- PCR检测
3.7 Western Blot
3.7.1 细胞总蛋白制备和定量
3.7.2 蛋白质电泳
3.7.3 电转移
3.7.4 抗原抗体反应及显色
3.7.5 结果分析
3.8 酶联免疫吸附试验检测 IL-1β，MMP-1 和 TIMP-1
3.9 生物信息技术预测miR-20a靶蛋白
3.10 荧光素酶报告基因实验
3.11 统计学分析
4 实验结果
4.1 大鼠AA模型的确立
4.2 NLRP3炎症小体在AA大鼠滑膜细胞中对炎症因子释放的影响及其作用机制
4.2.1 AA大鼠血清中炎症因子IL-1β 的表达
4.2.2 AA大鼠FLS培养上清液中IL-1β、MMP-1、TIMP-1的表达
4.2.3 IL-1β 对大鼠FLS增殖的影响
4.2.4 AA大鼠滑膜组织蛋白中NLRP3的表达
4.2.5 AA大鼠FLS的提取及NLRP3/ASC/casp-1 mRNA的表达
4.2.6 采用小干扰RNA技术沉默NLRP3，对NLRP3炎症小体及炎症因子IL-1β、MMP-1、TIMP-1 释放的影响。
4.3 TXNIP对NLRP3的表达及炎症因子释放的影响
4.3.1 AA大鼠滑膜组织蛋白中TXNIP的表达
4.3.2 AA大鼠FLS中TXNIP mRNA的表达
4.3.3 采用小干扰RNA技术沉默TXNIP，对NLRP3炎症小体及炎症因IL-1β、MMP-1、TIMP-1 释放的影响
4.4 AA大鼠FLS中mi R-20a对TXNIP表达的调控及对NLRP3炎症小体的表达和炎症因子IL-1β、MMP-1、TIMP-1 释放的影响
4.4.1 AA大鼠FLS中mi R-20a的表达
4.4.2 mi R-20a靶向调控TXNIP的表达
4.4.3 过表达miR-20a对TXNIP、NLRP3/ASC/caspase-1 及炎症因子IL-1β、MMP-1、TIMP-1 释放的影响
5.讨论
结论
参考文献
附录
致谢
综述
参考文献
本文编号：2950894
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
英文缩略词
中文摘要
Abstract
1 前言
2 实验材料
2.1 动物
2.2 试剂
2.3 主要仪器
2.4 溶液和试剂的配制
3. 实验方法
3.1 佐剂性关节炎（AA）大鼠模型的建立
3.2 佐剂性关节炎模型的确立
3.2.1 继发性足肿胀的测定
3.2.2 多发性关节炎指数（polyarthritis index, PI）评分
3.2.3 脾及胸腺指数
3.2.4 病理组织学检测
3.2.5 血清样本采集
3.3 大鼠滑膜细胞的分离与培养
3.3.1 大鼠滑膜组织的采集
3.3.2 大鼠滑膜细胞的分离
3.3.3 大鼠滑膜细胞的培养
3.4 MTT比色法测细胞增殖
3.5 脂质体瞬时转染NLRP3-siRNA、TXNIP-siRNA、mi R-20amimics进入FLS
3.6 qRT-PCR
3.6.1 细胞总RNA的提取
3.6.2 第一链cDNA的合成
3.6.3 qRT- PCR检测
3.7 Western Blot
3.7.1 细胞总蛋白制备和定量
3.7.2 蛋白质电泳
3.7.3 电转移
3.7.4 抗原抗体反应及显色
3.7.5 结果分析
3.8 酶联免疫吸附试验检测 IL-1β，MMP-1 和 TIMP-1
3.9 生物信息技术预测miR-20a靶蛋白
3.10 荧光素酶报告基因实验
3.11 统计学分析
4 实验结果
4.1 大鼠AA模型的确立
4.2 NLRP3炎症小体在AA大鼠滑膜细胞中对炎症因子释放的影响及其作用机制
4.2.1 AA大鼠血清中炎症因子IL-1β 的表达
4.2.2 AA大鼠FLS培养上清液中IL-1β、MMP-1、TIMP-1的表达
4.2.3 IL-1β 对大鼠FLS增殖的影响
4.2.4 AA大鼠滑膜组织蛋白中NLRP3的表达
4.2.5 AA大鼠FLS的提取及NLRP3/ASC/casp-1 mRNA的表达
4.2.6 采用小干扰RNA技术沉默NLRP3，对NLRP3炎症小体及炎症因子IL-1β、MMP-1、TIMP-1 释放的影响。
4.3 TXNIP对NLRP3的表达及炎症因子释放的影响
4.3.1 AA大鼠滑膜组织蛋白中TXNIP的表达
4.3.2 AA大鼠FLS中TXNIP mRNA的表达
4.3.3 采用小干扰RNA技术沉默TXNIP，对NLRP3炎症小体及炎症因IL-1β、MMP-1、TIMP-1 释放的影响
4.4 AA大鼠FLS中mi R-20a对TXNIP表达的调控及对NLRP3炎症小体的表达和炎症因子IL-1β、MMP-1、TIMP-1 释放的影响
4.4.1 AA大鼠FLS中mi R-20a的表达
4.4.2 mi R-20a靶向调控TXNIP的表达
4.4.3 过表达miR-20a对TXNIP、NLRP3/ASC/caspase-1 及炎症因子IL-1β、MMP-1、TIMP-1 释放的影响
5.讨论
结论
参考文献
附录
致谢
综述
参考文献
本文编号：2950894
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