重组新蛭素-Fc融合蛋白的构建表达及功能分析

发布时间：2021-01-02 16:27

　　心脑血管疾病是近年来威胁人类健康和生命的头号杀手,血栓形成是许多心脑血管疾病的重要诱因,血栓一旦形成,往往形成不可逆的严重后果,抗凝剂是防治血栓形成的重要药物。水蛭素（Hirudin,HV）是欧洲已上市的一个新型抗凝药物,它对凝血酶直接性强抑制,导致凝血参数急剧升高,新蛭素（Neorudin,EH）与水蛭素相比具有良好的特异靶向性,降低水蛭素非特异性导致的全身出血副作用,然而EH是一条小分子短肽,分子量只有7.3 KD,易被肾小球过滤,经尿液排出,使得EH在体内半衰期较短,只有1-2 h,为获得延长重组新蛭素（EH）的半衰期的融合蛋白,本实验制备了通过连接肽连接的重组新蛭素与IgG1 Fc的融合蛋白（EH-L-Fc）,并对其进行了功能分析。由于E.coli表达具有易操作、表达周期短等优点,真核表达系统具有对蛋白表达后修饰的优势,本实验分别构建原核、真核表达载体来获得融合蛋白。方法:采用重叠PCR技术构建pelB-eh-L-Fc/Eh-L-Fc融合基因,将pelB-eh-L-Fc克隆至表达载体pET-24a,Eh-L-Fc克隆至表达载体pcDNA3.1中,构建真核和原核表达载体。分别利用... 

【文章来源】：青岛科技大学山东省

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第1章 绪论
    1.1 心脑血管疾病现况
        1.1.1 血栓性疾病概况
        1.1.2 血栓性疾病治疗现状
    1.2 水蛭素
        1.2.1 水蛭素的结构功能
        1.2.2 凝血酶结构与功能
        1.2.3 水蛭素的优势与弊端
        1.2.4 新蛭素
    1.3 融合蛋白类药物
        1.3.1 蛋白药物代谢
        1.3.2 融合蛋白类型
        1.3.3 PEG化修饰药物
        1.3.4 Fc融合蛋白
            1.3.4.1 Fc融合蛋白简介
            1.3.4.2 FcRn介绍及其延长半衰期的原理
            1.3.4.3 Fc的结合位点突变
            1.3.4.4 Fc融合蛋白的目前进展
    1.4 融合蛋白连接短肽
        1.4.1 Linker的类型
        1.4.2 Linker的设计
    1.5 实验设计与技术路线
        1.5.1 实验设计
        1.5.2 技术路线
    1.6 研究目的与意义
第2章 不同连接肽pET-24a-pelB-eh-L-Fc的构建及其在E.coli BL21中的表达
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 主要试剂配制
        2.1.5 实验所用序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 目的基因扩增
        2.2.2 pET-24a-pelB-eh-L-Fc重组质粒的构建
            2.2.2.1 双酶切
            2.2.2.2 连接转化
        2.2.3 重组表达载体pET-24a-pelB-eh-L-Fc的验证
            2.2.3.1 菌液PCR鉴定阳性克隆
            2.2.3.2 双酶切鉴定阳性克隆
            2.2.3.3 送测序鉴定阳性克隆
        2.2.4 重组pET-24a-pelB-eh-L-Fc质粒在E.coli BL21中诱导表达
            2.2.4.1 重组pET-24a-pelB-eh-L-Fc载体摇瓶的表达条件优化
            2.2.4.2 样品处理
            2.2.4.3 目的蛋白的鉴定及表达方式的确定
    2.3 实验结果
        2.3.1 PCR扩增基因片段结果
        2.3.2 SOE-PCR获得融合目的基因
        2.3.3 pET-24a-pelB-eh-L-Fc质粒验证结果图
        2.3.4 目的蛋白诱导表达及鉴定
            2.3.4.1 IPTG对菌体生长的影响
            2.3.4.2 融合蛋白表达检测
    2.4 讨论
    2.5 本章结论
第3章 pcDNA3.1-Eh-L-Fc在CHO细胞中的表达、纯化及活性分析
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 主要试剂配制
        3.1.5 实验所用序列
    3.2 实验方法
        3.2.1 表达载体构建
        3.2.2 CHO的培养、转染与筛选
            3.2.2.1 DMEM-F12培养基的配置
            3.2.2.2 CHO细胞复苏
            3.2.2.3 细胞传代
            3.2.2.4 细胞计数与铺孔板
            3.2.2.5 瞬时转染CHO细胞
            3.2.2.6 G418筛选浓度确定
            3.2.2.7 稳定高表达细胞株的筛选
            3.2.2.8 细胞冻存
        3.2.3 蛋白表达检测
            3.2.3.1 转录水平检测蛋白表达
            3.2.3.2 Western Blot检测蛋白表达
        3.2.4 融合蛋白的表达纯化
        3.2.5 纯化蛋白浓度与纯度检测
            3.2.5.1 纯化蛋白浓度测定
            3.2.5.2 纯化蛋白纯度测定
        3.2.6 融合蛋白分子量测定
        3.2.7 体外活性检测
            3.2.7.1 溶液的配制
            3.2.7.2 融合蛋白活性测定
            3.2.7.3 活性单位的定议和计算
    3.3 实验结果
        3.3.1 目的基因的PCR扩增
        3.3.2 重组表达载体的构建及验证
        3.3.3 转录水平（RT-PCR）检测融合蛋白表达
        3.3.4 翻译水平检测融合蛋白的表达
        3.3.5 稳定性检测
        3.3.6 EH-L-Fc蛋白的纯化及检测
        3.3.7 融合蛋白表达量比较
        3.3.8 生物活性检测
    3.4 讨论
    3.5 本章结论
第4章 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：2953246