顶头孢霉高低产菌初级代谢基因序列分析及ssadh基因功能研究

发布时间：2021-01-18 23:14

　　工业上生产β-内酰胺类抗生素的重要前体头孢菌素C依靠其巨大的经济价值在抗生素市场上起着相当重要的作用,其主要生产菌丝状真菌顶头孢霉的研究也因此备受重视。顶头孢霉在经历了传统育种技术的多轮诱变和筛选过程后,其CPC生产能力得到显著提升,但其高产背后发生的遗传变异及代谢差异的分子机制尚未完全披露,这也在很大程度上限制了从分子育种角度进一步提升CPC产量的可能。目前,我们认识和理解顶头孢霉的代谢网络、调控机制得益于头孢菌素C生物合成途径的阐明和组学技术的应用,野生型菌株ATCC11550基因组测序的完成也使得顶头孢霉比较基因组学的研究得以开展。我们设想通过研究顶头孢霉高产菌株和野生型菌株之间的基因组差异,并结合之前本实验室此前获得的转录组学和蛋白质组学数据,对在菌种选育过程中发生的代谢调控突变进行全面深入的研究,探寻代谢调控突变影响CPC合成的机制。本文着眼于顶头孢霉高低产菌CPC合成相关初级代谢途径的基因序列分析,通过考察这些基因是否在高产菌株中发生突变从而影响到酶的活性,并结合之前转录水平的分析结果初步探究可能对头孢菌素C代谢产生影响的因素。首先,以顶头孢霉高产菌株LD-7基因组为模板,... 

【文章来源】：中国医药工业研究总院上海市

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

头孢菌素C生物合成基因簇及合成途径Fig.1-1BiosyntheticgeneclustersandsyntheticpathwaysofcephalosporinC

图 1-2 头孢菌素 C 的生物合成及其细胞内运输[8]Fig.1-2 Biosynthetic pathway and intracellular transport of CPC尽管 CPC 的生物合成途径已被基本阐明，但由于顶头孢霉的遗传操作困次级代谢的网络又十分复杂，研究人员对 CPC 合成过程中复杂的调控机少，目前仅研究发现了少数几个与 CPC 合成相关的调控基因(图 1-3)。例基中添加葡萄糖时，由基因 cre1 编码的葡萄糖依赖型抑制蛋白 CRE1 能子区域直接结合，达到抑制 CPC 合成基因 pcbC 和 cefEF 转录的目的[9]型锌指转录调控因子 PACC 调控基因转录的过程是通过结合两个双向启AB-pcbC 和 cefEF-cefG 的特定位点来实现的[10]。与人类转录调控因子 X(同源的蛋白 CPCR1 可以控制菌丝片段化以及节孢子的形成，能够至少识位于 pcbAB 和 pcbC 基因间区的两段序列。lacZ 报告基因的活性会因为C 启动子区的两个 CPCR1 识别位点的同时缺失而大幅度降低；另外，pcb水平也会在敲除CPCR1后大幅下降，随之减少的则是中间物青霉素N的产这一系列的变化却并没有引起 CPC 产量的变化，由此可以看出 CPC 的生

级代谢调控的因子常常对 CPC 的生物合成也具有调控作用，它们很可能是在这种交互调控的过程中发挥了关键作用。例如氮源调控基因 AcareA 和 AcareB 不仅在NH4+、谷氨酰胺和尿素这些氮源的利用中起着关键作用，基因 AcareA 和 AcareB的缺失都可以导致 CPC 合成相关基因的转录水平及 CPC 产量的显著降低。AcAreA能够直接结合于pcbAB与pcbC之间的双向启动子区，而AcAreB还能与cefD1-cefD2和 cefEF-cefG 的基因间隔区结合。研究还发现 AcAreA 能够正向调控 AcareB 基因的转录，AcAreB 却不能调控 AcareA 基因的转录[15,16]。AcsepH 基因与菌丝分隔有关，它的突变能够导致分生孢子产量下降 90%之多，并且有 20%的多细胞核分生孢子的 CPC 产量也有大幅度的下降，同时还会导致pcbC 基因转录延迟，cefEF、cefD1 和 cefD2 的转录水平也明显降低[17]。AcstuA 基因也可以在转录水平上调控 CPC 的合成，是另一个与分生孢子产生相关的调控基因，还参与细胞壁完整性的调控，当敲除 AcstuA 后，菌丝会呈现不规则的膨胀和断裂[18]。对 CPC 合成与菌丝形态分化之间关系的研究，将不断加深我们对顶头孢霉中头孢菌素 C 产生的认识和理解。


本文编号：2985847