甲氨蝶呤对大鼠脊髓损伤的药效作用研究

发布时间：2017-04-13 09:18

  本文关键词：甲氨蝶呤对大鼠脊髓损伤的药效作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：评价传统抗炎药甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)对大鼠继发性脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)的治疗效果,包括对氧化应激、炎症、水肿、神经细胞凋亡机制的抑制作用,并与经典治疗SCI药物甲强龙(methylprednisolone, MP)进行比较,以及探索MTX与MP联合治疗对SCI大鼠运动功能及基因表达谱的影响,探讨联合作用的分子机制。从而希望为明确MTX对于SCI的作用效果提供有效的实验数据,以及为临床上寻找到更合适的药物治疗方式提供新思路。方法：1.将成年SD大鼠随机分为Model组、MTX组、MP组和Sham组,采用连有PinPointTM高精度接触传感器的立体撞击器建立SCI模型。术后30 min, MTX组颈部皮下注射MTX (0.5mg/kg·BW), MP组尾静脉注射MP (30mg/kg-BW)。 Model组伤后不做给药处理,假手术组仅进行T10椎板切除术。通过ELISA方法检测伤后3h、6h、12h和48h的MDA、8-iso-PGF2α、4-HNE、3-NT、AOPP、 Protein carbonyl和8-OHdG含量,通过荧光定量PCR方法检测伤后3h、6h、12h和48h的AQP4、TNF-α、IL-1β、Bax、Bcl-x和Bcl-2的表达量,并通过免疫组织化学染色法观察损伤中心及邻近区域的神经元存活状况。2.将成年SD大鼠术前在ZH-PT计算机控制动物实验跑台进行适应性训练5天。然后随机分为Model组、MTX组、MP组.MTX+MP组和Sham组。术后30 min,MTX组颈部皮下注射MTX (0.5 mg/kg-BW), MP组尾静脉注射MP (30 mg/kg·BW), MTX+MP组先于伤后30 mmin尾静脉注射MP (30mg/kg),再于伤后1d起颈部皮下注射MTX (0.3 mg/kg),并隔日给药,连续2 w。Model组伤后不做给药处理,Sham组仅作T10椎板切除术。应用TreadScan步态分析系统描述术前及伤后2、4、8 w大鼠的行为学特征。术后8 w,处死大鼠,并对脊髓组织进行基因表达谱分析。结果：1. ELISA结果显示MTX治疗后七个氧化指标含量均较Model组降低,仅在个别时间点与MP组相比抑制效果稍差。PCR定量结果显示,MTX治疗后AQP4、TNF-α、IL-1β和Bax的mRNA表达量较Model组降低,Bcl-x和Bcl-2的表达量较Model组升高,仅在个别时间点恢复效果不如MP组。MTX组伤后3d时NeuN免疫组化染色观察到离损伤中心前后3mm和5mm处则较Model的存活神经元数目明显增多,且与MP组未出现显著性差异。2.行为学：① Model组与Sham组比较,摆动时间、跨步时间、最小纵向偏差显著升高,而瞬间跑速、脚印面积和正常步序显著降低(P0.05)；②MP组与Model组相比较,各步态参数较均有显著改善(P0.05),但随着时间延长改善效果不再增加；③MP+MTX组与MP组比较,步态恢复效果好,且均于伤后3w或(和)4w表现出显著差异(P0.05)。基因表达谱：①Model组与Sham组比较,基因表达差异体现在生命活动的各个方面；②MP组与Model组比较,上调基因主要涉及：促神经恢复、抗炎、抗氧化、抗凋亡；下调基因主要涉及：促氧化、促炎；③MP+MTX组与MP组比较,上调基因主要涉及：促神经恢复、抗氧化、抗炎、抗凋亡；下调基因主要涉及：促炎和促凋亡。结论：1.早期采用MTX治疗大鼠SCI可有效抑制氧化应激、炎症、水肿和凋亡机制的发生发展,虽然短期作用效果不如MP明显,但由于MTX的治疗时间灵活,可伤后持续给药,因此作用效果可于伤后累加。2.MTX与MP联合治疗可有效改善SCI大鼠后肢运动功能,并对伤后氧化应激、炎症、凋亡具有较好的抑制作用,恢复神经组织结构和功能,发挥神经保护作用。
【关键词】：脊髓损伤 甲氨蝶呤 大鼠 作用机制
【学位授予单位】：江西科技师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 绪论13-23
• 1.1 研究意义13-14
• 1.2 文献综述14-22
• 1.2.1 氧化应激14-18
• 1.2.2 氧化应激参与脊髓损伤的病理生理机制18-19
• 1.2.3 脊髓损伤后的抗氧化药物治疗进展19-22
• 1.3 结论与展望22-23
• 第二章 甲氨蝶呤早期治疗大鼠脊髓损伤的研究23-55
• 2.1 实验材料23-27
• 2.1.1 药品与试剂23-25
• 2.1.2 溶液配制25-26
• 2.1.3 实验仪器26-27
• 2.1.4 实验动物27
• 2.2 实验方法27-40
• 2.2.1 实验分组27-28
• 2.2.2 模型制备28
• 2.2.3 术后护理28-29
• 2.2.4 采血及组织取材29
• 2.2.5 分子生物学检测29-39
• 2.2.5.1 ELISA检测30-37
• 2.2.5.2 荧光定量PCR37-38
• 2.2.5.3 免疫组织化学染色38-39
• 2.2.6 图像采集39
• 2.2.7 统计分析39-40
• 2.3 结果40-49
• 2.3.1 氧化应激40-44
• 2.3.1.1 脂质过氧化40-41
• 2.3.1.2 蛋白氧化损伤41-43
• 2.3.1.3 核酸氧化损伤43-44
• 2.3.2 炎症44-45
• 2.3.3 水肿45-46
• 2.3.4 凋亡46-49
• 2.4 讨论49-55
• 第三章 甲氨蝶呤联合甲强龙长期治疗大鼠脊髓损伤的研究55-91
• 3.1 实验材料55-58
• 3.1.1 药品和试剂55-57
• 3.1.2 溶液配制57
• 3.1.3 实验仪器57-58
• 3.1.4 实验动物58
• 3.2 实验方法58-71
• 3.2.1 实验分组58
• 3.2.2 模型制备58-59
• 3.2.3 术后护理59
• 3.2.4 步态分析59-60
• 3.2.5 组织取材60
• 3.2.6 基因表达谱分析60-69
• 3.2.6.1 总RNA提取和纯化60-64
• 3.2.6.2 mRNA反转录64-67
• 3.2.6.3 Solexa基因测序和RNA-Seq生物信息学分析67-69
• 3.2.7 荧光定量PCR验证69-71
• 3.2.8 统计分析71
• 3.3 实验结果71-85
• 3.3.1 运动功能评价71-74
• 3.3.2 Solexa基因测序74-83
• 3.3.2.1 SCI造成的损伤前后基因差异表达74-76
• 3.3.2.2 药物治疗对基因差异表达的影响76-83
• 3.3.3 荧光定量PCR验证结果83-85
• 3.4 讨论85-91
• 3.4.1 步态分析85-86
• 3.4.2 基因差异表达分析86-91
• 3.4.2.1 MP治疗87-88
• 3.4.2.2 MP+MTX联合治疗88-91
• 第四章 结论91-92
• 参考文献92-104
• 攻读硕士期间的研究成果104-105
• 致谢105

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