化疗药物激活caspase-3切割GSDME引发细胞焦亡

发布时间：2021-02-26 00:53

　　细胞焦亡（Pyroptosis）是一种全新的程序性细胞死亡方式（Programmed cell death,PCD）。不同于细胞凋亡（Apoptosis）,细胞焦亡的过程伴随着细胞内容物释放,是一种会促发炎症的程序性坏死。经典的细胞焦亡由炎症性半胱氨酸天冬蛋白酶（Inflammatory caspases）介导,包括半胱氨酸天冬蛋白酶-1/4/5/11（caspase-l/4/5/11）。病原微生物感染宿主时,病原微生物来源的病原相关模式分子（Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）可以被宿主细胞的模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）所识别,进而组装成为炎症小体（Inflammasome）,招募caspase-1使其自剪切而活化。细胞内部的caspase-4/5/11可以直接结合革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）而发生自身寡聚活化。活化后的caspase-1/4/5/11均可以切割共同底物gasdermin-D（GSDMD）。GSDMD的N端蛋白具有细胞膜打孔的功能。当其全长蛋白的铰链区被活化... 

【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：100 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
中英文缩略词表
第一章 文献综述
    1.1 细胞焦亡
        1.1.1 细胞焦亡现象的发现
        1.1.2 Caspase-1的激活机制
        1.1.3 Caspase-4/5/11的激活机制
    1.2 GSDMD
        1.2.1 GSDMD是细胞焦亡的执行分子
        1.2.2 GSDMD是caspase-1/4/5/11的底物
        1.2.3 GSDMD的N端结构域具有细胞膜打孔活性
    1.3 GSDME
        1.3.1 Gasdermin家族
        1.3.2 GSDME
    1.4 细胞凋亡
        1.4.1 细胞凋亡信号通路
        1.4.2 半胱氨酸天冬蛋白酶（caspase）
第二章 材料与方法
    1.1 实验材料
        1.1.1 细胞系
        1.1.2 野生型小鼠
        1.1.3 Gsdme敲除小鼠
    1.2 实验试剂
        1.2.1 实验用药物
        1.2.2 重组蛋白
        1.2.3 PCR试剂
        1.2.4 RNA提取及反转录试剂
        1.2.5 流式分析相关试剂
        1.2.6 其它实验相关试剂
    1.3 抗体
        1.3.1 Western blot一抗
        1.3.2 Wetern blot二抗
    1.4 常用试剂配制
        1.4.1 TBS-T缓冲液
        1.4.2 SDS-PAGE电泳缓冲液
        1.4.3 半干转缓冲液
        1.4.4 LB培养基（1L）
        1.4.5 2X YT培养基（1L）
    1.5 主要仪器设备
        1.5.1 细胞培养相关仪器
        1.5.2 显微镜
        1.5.3 流式细胞分选仪
        1.5.4 其它常规仪器
    1.6 实验方法
        1.6.1 Spinning Disk显微镜拍摄
        1.6.2 Western blot
        1.6.3 大肠杆菌纯化重组蛋白
        1.6.4 慢病毒系统制做稳定表达特定基因的细胞系
        1.6.5 体外活性形式的caspases切割蛋白底物
        1.6.6 细胞死亡（Cell death）的检测
        1.6.7 细胞存活（Cell survival）的检测
        1.6.8 基因敲除细胞系的构建
        1.6.9 siRNA介导的基因敲低
第三章 实验结果和分析
    3.1 GSDME将caspase-3介导的细胞凋亡转化为细胞焦亡
        3.1.1 TNF诱导高表达GSDME的HeLa细胞发生细胞焦亡
        3.1.2 化疗药物诱导高表达GSDME的HeLa细胞发生细胞焦亡
        3.1.3 caspase-3切割GSDME引发细胞焦亡
        3.1.4 GSDME的表达量对细胞焦亡的影响
    3.2 caspase-3可以体外切割GSDME释放其膜打孔活性
        3.2.1 caspase-3可以体外切割GSDME
        3.2.2 GSDME的N端结构域可以结合磷脂
        3.2.3 GSDME的N端结构域具有膜打孔活性
        3.2.4 GSDME耳聋突变体蛋白可以引起细胞焦亡
        3.2.5 GSDME耳聋突变体蛋白在细胞内可以被快速降解
    3.3 化疗药物通过激活内源GSDME引起细胞焦亡
        3.3.1 化疗药物可以引起高表达GSDME的癌细胞发生细胞焦亡
        3.3.2 化疗药物诱导癌细胞焦亡依赖于GSDME
        3.3.3 化疗药物激活caspase-3切割内源的GSDME
    3.4 GSDME在肿瘤细胞里被沉默
        3.4.1 NCI-60里GSDME的表达情况
        3.4.2 化疗药物诱导NCI-H522发生GSDME依赖的细胞焦亡
    3.5 化疗药物通过GSDME引起原代细胞焦亡
        3.5.1 GSDME在原代细胞里高表达
        3.5.2 化疗药物可以引起高表达GSDME的原代细胞发生焦亡
        3.5.3 化疗药物可以引起原代细胞内部的GSDME的切割
        3.5.4 化疗药物引起原代细胞焦亡依赖于GSDME
    3.6 caspase-3切割GSDME诱导细胞焦亡在鼠源细胞上保守
        3.6.1 大多数鼠源的肿瘤细胞不表达GSDME
        3.6.2 GSDME介导的细胞焦亡在鼠源细胞上同样保守
        3.6.3 化疗药物引发机体副作用的小鼠模型
第四章 讨论
    4.1 GSDME决定了caspase-3激活之后发生细胞凋亡还是细胞焦亡
    4.2 GSDME是化疗副作用的关键分子
    4.3 GSDME在提高肿瘤免疫原性的应用
第五章 结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3051830