BIrisin在组织工程骨中应用的实验研究
发布时间：2021-03-01 21:20
目的:通过研究鸢尾素（Irisin）对大鼠BMSCs成骨分化的影响及相关信号通路,探讨Irisin作为组织工程骨生长因子的可行性及其对骨缺损愈合的影响。方法:体外培养大鼠BMSCs,分离纯化、鉴定;设置Irisin不同浓度组（0、80ng/mL、100ng/mL、120ng/mL）,CCK-8法选择Irisin的最佳实验浓度。含有Irisin的培养液培养大鼠BMSCs为实验组,单纯培养液培养为对照组,3、7、14天进行茜素红、von Kossa钙盐染色;3、10天进行RT-PCR和Western bolt检测,分析成骨相关基因的mRNA及蛋白表达。建立股骨缺损的大鼠模型,实验分3组:实验组:Irisin复合支架;对照组:无Irisin复合支架;空白组。将三组材料植入大鼠模型的缺损区域,MicroCT、HE染色及免疫组化分析,检测缺损区域的骨愈合和皮质骨再生情况。结果:1.流式细胞测定表明:BMSCs表面表达CD29（98.4%±2.1%）在高水平,CD45（2.9%±0.4%）表达低水平。2.从3天开始浓度100ng/mL的培养液促进大鼠BMSCs增殖活性的效果逐渐明显（P<0....
【文章来源】：新疆医科大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BMSCS细胞膜的培养及细胞膜-支架复合物的构建(50×)
新疆医科大学硕士学位论文11图2组织工程骨模型回植过程Fig.2Tissueengineeringbonemodelreplantingprocess2.7组织工程骨回植动物的相关检测3D打印组织工程支架包裹预先浸提的细胞膜片（OM），回植SD大鼠股骨缺损模型，设置实验组和对照组，并分别在第1个月、第2个月、第3个月时点，采集标本，行Micro-CT、HE染色、免疫组化等指标检测，结合体外实验结果，由此证实Irisin为体外、体内性能俱佳的组织工程骨生长因子。2.7.1大体观察按期处理实验动物时先进行创口愈合情况评估：取出标本前按期观察大鼠是否出现异常，是否出现消瘦，有无后肢活动障碍，伤口愈合是否延迟。取出标本时观察大鼠股骨是否有感染坏死情况，是否出现炎症反应，移植支架与周围骨组织愈合情况，缺损周围新骨形成，血供情况，支架初步降解情况等。2.7.2MicroCT分析骨缺损区的ROI区域按照实验时间，对所有组的小鼠实施安乐死。分离出整个股骨并使用微型CT扫描。工作电压为55kV，工作电流为145mA，以支架回植区域扩张1mm为实验缺损区为感兴趣区(regionofinterestROI)，扫描层的深度为20um，扫描的时间为3400msec。分析骨骼再生情况并计算新形成的骨骼的骨体积。通过比较MicroCT各项观察值，评估缺损区ROI区域的新生骨质情况和皮质骨的生长情况，以及骨缺损的各项指标。2.7.3HE染色分析苏木精和伊红（HE）染色在室温下进行，以观察新形成的骨骼的骨再生状况。
新疆医科大学硕士学位论文14结果1BMSCs分离、培养与鉴定结果1.1大鼠BMSCs分离培养绘制生长曲线图如图3所示，镜下观察SD大鼠骨髓间充质干细胞的形态变化。长期观察总结成熟BMSCs细胞形态规律，排列具有趋向性，表现为长条形或梭形，个别变现椭圆形，随着换液传代，细胞逐渐纯化，排列愈加规律，形态特征更加明显。BMSCs分离培养后各代绘制的生长曲线图见图4。由图可见，在传代培养过程中，骨髓间充质干细胞可迅速贴壁生长，观察发现大约在传代后3小时后开始粘附。细胞接种完成后生长较为缓慢，此阶段为细胞生长的适应期；在大约3天时开始快速增殖，具有累积的细胞数，进去细胞生长的对数期，持续约4-6天；之后细胞增长速度逐渐趋于缓慢，进去平台期。其中第三代细胞（P3）生长最为旺盛。abcd注：a:P1代细胞、b:P2代细胞、c:P3代细胞、d:P5代细胞P1代细胞融合度未达到95％，细胞中存在杂细胞；P2代细胞杂细胞数量减少，细胞排列较规律，形态呈现长梭形；P3代细胞融合度95％以上，且排列出显著的方向性，活力旺盛。P5代细胞，细胞出现老化，融合度有所减少。图3体外培养大鼠BMSCs各代细胞镜下形态（5x）Fig.3CytologicalmorphologyofratBMSCsinvitro（5x）图4P1、P3和P5代大鼠BMSCs生长曲线Fig.4GrowthcurvesofratBMSCsinP1,P3andP5generations
【参考文献】：
期刊论文
[1]Irisin对高糖环境中BMSCs骨向分化的影响及机制研究[J]. 李金儒,位朵,甄国朋,郭滨. 华南国防医学杂志. 2019(07)
[2]Exercise-induced irisin in bone and systemic irisin administration reveal new regulatory mechanisms of bone metabolism[J]. Jin Zhang,Paloma Valverde,Xiaofang Zhu,Dana Murray,Yuwei Wu,Liming Yu,Hua Jiang,Michel M Dard,Jin Huang,Zhiwei Xu,Qisheng Tu,Jake Chen. Bone Research. 2017(01)
本文编号：3058045
【文章来源】：新疆医科大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BMSCS细胞膜的培养及细胞膜-支架复合物的构建(50×)
新疆医科大学硕士学位论文11图2组织工程骨模型回植过程Fig.2Tissueengineeringbonemodelreplantingprocess2.7组织工程骨回植动物的相关检测3D打印组织工程支架包裹预先浸提的细胞膜片（OM），回植SD大鼠股骨缺损模型，设置实验组和对照组，并分别在第1个月、第2个月、第3个月时点，采集标本，行Micro-CT、HE染色、免疫组化等指标检测，结合体外实验结果，由此证实Irisin为体外、体内性能俱佳的组织工程骨生长因子。2.7.1大体观察按期处理实验动物时先进行创口愈合情况评估：取出标本前按期观察大鼠是否出现异常，是否出现消瘦，有无后肢活动障碍，伤口愈合是否延迟。取出标本时观察大鼠股骨是否有感染坏死情况，是否出现炎症反应，移植支架与周围骨组织愈合情况，缺损周围新骨形成，血供情况，支架初步降解情况等。2.7.2MicroCT分析骨缺损区的ROI区域按照实验时间，对所有组的小鼠实施安乐死。分离出整个股骨并使用微型CT扫描。工作电压为55kV，工作电流为145mA，以支架回植区域扩张1mm为实验缺损区为感兴趣区(regionofinterestROI)，扫描层的深度为20um，扫描的时间为3400msec。分析骨骼再生情况并计算新形成的骨骼的骨体积。通过比较MicroCT各项观察值，评估缺损区ROI区域的新生骨质情况和皮质骨的生长情况，以及骨缺损的各项指标。2.7.3HE染色分析苏木精和伊红（HE）染色在室温下进行，以观察新形成的骨骼的骨再生状况。
新疆医科大学硕士学位论文14结果1BMSCs分离、培养与鉴定结果1.1大鼠BMSCs分离培养绘制生长曲线图如图3所示，镜下观察SD大鼠骨髓间充质干细胞的形态变化。长期观察总结成熟BMSCs细胞形态规律，排列具有趋向性，表现为长条形或梭形，个别变现椭圆形，随着换液传代，细胞逐渐纯化，排列愈加规律，形态特征更加明显。BMSCs分离培养后各代绘制的生长曲线图见图4。由图可见，在传代培养过程中，骨髓间充质干细胞可迅速贴壁生长，观察发现大约在传代后3小时后开始粘附。细胞接种完成后生长较为缓慢，此阶段为细胞生长的适应期；在大约3天时开始快速增殖，具有累积的细胞数，进去细胞生长的对数期，持续约4-6天；之后细胞增长速度逐渐趋于缓慢，进去平台期。其中第三代细胞（P3）生长最为旺盛。abcd注：a:P1代细胞、b:P2代细胞、c:P3代细胞、d:P5代细胞P1代细胞融合度未达到95％，细胞中存在杂细胞；P2代细胞杂细胞数量减少，细胞排列较规律，形态呈现长梭形；P3代细胞融合度95％以上，且排列出显著的方向性，活力旺盛。P5代细胞，细胞出现老化，融合度有所减少。图3体外培养大鼠BMSCs各代细胞镜下形态（5x）Fig.3CytologicalmorphologyofratBMSCsinvitro（5x）图4P1、P3和P5代大鼠BMSCs生长曲线Fig.4GrowthcurvesofratBMSCsinP1,P3andP5generations
【参考文献】：
期刊论文
[1]Irisin对高糖环境中BMSCs骨向分化的影响及机制研究[J]. 李金儒,位朵,甄国朋,郭滨. 华南国防医学杂志. 2019(07)
[2]Exercise-induced irisin in bone and systemic irisin administration reveal new regulatory mechanisms of bone metabolism[J]. Jin Zhang,Paloma Valverde,Xiaofang Zhu,Dana Murray,Yuwei Wu,Liming Yu,Hua Jiang,Michel M Dard,Jin Huang,Zhiwei Xu,Qisheng Tu,Jake Chen. Bone Research. 2017(01)
本文编号：3058045
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