2型囊泡谷氨酸转运体与神经病理性疼痛的相关性研究

发布时间：2017-04-15 19:25

  本文关键词：2型囊泡谷氨酸转运体与神经病理性疼痛的相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景谷氨酸在疼痛信号的传递和调控过程中发挥关键作用。已有大量研究证实,神经病理性疼痛与谷氨酸过度释放有关。囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters,VGLUTs),负责将胞内的谷氨酸摄取入囊泡,完成谷氨酸的储存、隔离和释放,因此对突触间隙的谷氨酸动态平衡具有重要影响。在VGLUTs的3个亚型中,2型囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2)主要表达于脊髓、丘脑和低位脑干,在一些杏仁核和皮层结构中也有表达,提示VGLUT2可能参与了疼痛信号的传递和加工。近期的研究发现VGLUT2表达降低的小鼠神经病理性疼痛表现消失或减弱,同时VGLUT2表达降低导致丘脑神经元兴奋性突触后电流幅度和频率下降,进一步表明VGLUT2与神经病理性疼痛相关。尽管如此,神经病理性疼痛发生发展过程中VGLUT2的表达是否发生改变,VGLUT2的表达变化如何影响谷氨酸能神经传递,抑制VGLUT2的功能能否对抗疼痛等等还鲜有报道。本研究室前期研究发现,神经病理痛大鼠的背根神经节、脊髓中VGLUT2的表达上调,本研究重点关注神经病理痛进程中小鼠脑内VGLUT2的表达和功能变化,以及VGLUT抑制剂对谷氨酸释放和疼痛行为的影响。研究目的研究神经病理性疼痛发生发展过程中小鼠脑内VGLUT2表达与功能的改变及其影响疼痛信息传递的机制,观察VGLUT抑制剂功能对动物疼痛反应和谷氨酸释放的影响。研究方法第一部分是建立神经病理性疼痛模型,观察不同时间点疼痛相关脑区VGLUT2表达的改变,探讨VGLUT2表达改变对谷氨酸囊泡摄取和释放的影响。包括:1)建立坐骨神经选择性损伤(spared nerve injury,SNI)模型:结扎并剪断C57小鼠坐骨神经三个分支中的腓总神经和胫神经,保持腓肠神经不受损伤。术后以Von Frey法测试动物腓肠神经支配域机械痛阈的变化。2)VGLUT2表达检测:于SNI造模后不同时间(0.5,1,1.5,3,7,14,28天)取小鼠全脑,采用免疫组织化学法检测丘脑、水管周围灰质(Periaqueductal gray,PAG)、双侧杏仁核和双侧内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,m PFC)中VGLUT2表达的改变。3)VGLUT2功能检测:在囊泡谷氨酸摄取实验中,分别于SNI造模后1天和14天,分离丘脑突触囊泡并与系列浓度的谷氨酸共同孵育,应用微透析和HPLC-ECD测定孵育液中谷氨酸浓度的变化,以此反映谷氨酸的囊泡摄取;在突触体谷氨酸释放实验中,分别于SNI造模后1天和14天,制备丘脑突触体,与谷氨酸脱氢酶及NADP+共孵育,通过荧光酶标仪检测反应产物NADPH的荧光强度,以确定孵育液中谷氨酸浓度。第二部分是选择系列VGLUT功能抑制剂作为工具药,研究抑制剂对神经痛小鼠机械痛阈和丘脑谷氨酸释放的影响,以及对疼痛相关脑区神经元c-Fos表达的影响;观察抑制剂对动物运动协调能力与其他疼痛行为的影响。包括1)抑制VGLUT功能对疼痛的影响:在SNI和奥沙利铂诱发神经痛的形成期或维持期,脑室给药VGLUT抑制剂,观察动物机械痛阈的变化。2)对运动协调性和其他疼痛的作用:采用转棒实验研究VGLUT抑制剂脑室给药对动物运动协调性的影响,并在小鼠热板模型、福尔马林模型及醋酸扭体模型上对抑制剂进行作用研究。3)对c-Fos表达的影响:免疫组化法检测抑制剂对SNI术后早期脑内c-Fos表达的影响。4)突触体谷氨酸释放的测定:SNI造模后1天提取动物的丘脑突触体,与VGLUT抑制剂共孵育,荧光酶标仪检测抑制剂对动物去极化引发的谷氨酸释放的影响。研究结果1)SNI术后VGLUT2表达和功能的改变SNI造模后1天,丘脑、PAG和双侧杏仁核中VGLUT2表达均显著升高,从造模后1.5天开始到28天VGLUT2表达逐渐下降到假手术水平;SNI术后1天,小鼠丘脑突触体囊泡的谷氨酸摄取速率,在外加谷氨酸浓度为1000μM和2000μM时显著升高,而SNI术后14天的谷氨酸摄取速率没有明显变化;SNI术后1天,小鼠丘脑突触体去极化引发的谷氨酸释放明显升高,在术后14天,谷氨酸的释放与假手术组相比没有明显差别。2)VGLUT抑制剂对神经痛疼痛反应的影响SNI损伤后立即脑室注射VGLUT抑制剂CSB6B(5μg/只)、Rose Bengal(5μg/只)、Xanthurenic Acid(10μg/只)、Brilliant Yellow(5μg/只)之后每12小时注射一次,与溶剂组(a CSF,5μl/只)相比,能显著抑制SNI术后0.5天和1天的动物机械痛阈下降,而在SNI术后的疼痛维持期,CSB6B和Rose Bengal(5μg,i.c.v.)没有明显的镇痛作用;在奥沙利铂致神经痛模型上,造模同时每12小时CSB6B(5μg,i.c.v.)伴随给药,与模型组相比,能够明显抑制奥沙利铂第一次给药后1.5到4天的动物机械痛阈下降。CSB6B(1 mg·kg-1,i.p.)预防或治疗性给药对SNI诱发的机械痛敏均无显著的镇痛作用。3)VGLUT抑制剂对对运动协调性和其他疼痛的影响动物运动协调功能的研究表明,CSB6B(5μg,i.c.v.)对小鼠的转棒掉落潜伏期没有明显影响。CSB6B(2.5 mg·kg-1,i.p.)对小鼠50和55℃的热板反应没有明显的影响;CSB6B(2.5 mg·kg-1,i.p.)作用30 min和60 min能够明显抑制醋酸引发的小鼠扭体反应;CSB6B(0.5 mg·kg-1,i.p.)作用30 min后能够明显降低小鼠福尔马林模型的二相舔足时间,而对福尔马林一相疼痛没有明显影响。4)VGLUT抑制剂对神经痛c-Fos表达和谷氨酸释放的影响c-Fos表达的检测结果表明,丘脑、PAG在SNI术后1天,PAG和对侧m PFC在SNI术后1.5天时,与假手术组相比,模型组神经元c-Fos的表达明显上升;与模型组相比,CSB6B(5μg,i.c.v.)能够明显降低丘脑在SNI术后0.5天与对侧m PFC在术后1.5天的c-Fos表达。进一步实验表明,CSB6B与SNI术后丘脑突触体共孵育30 min后能够明显抑制突触的谷氨酸释放,IC50为25.7μM。结论神经病理性疼痛早期脑内VGLUT2表达升高,同时丘脑神经元囊泡谷氨酸摄取和突触体谷氨酸释放能力均显著增强,提示VGLUT2在神经痛早期发挥了作用。VGLUT功能抑制剂不影响动物运动协调能力,却可缓解动物神经痛早期的机械痛敏,抑制神经痛诱导的c-Fos表达。VGLUT的作用机制可能与抑制丘脑突触体谷氨酸释放有关。本研究结果表明,神经病理性疼痛可引起脑内VGLUT2的表达和功能发生改变,VGLUT抑制剂可延缓痛敏形成。
【关键词】：神经病理性疼痛 VGLUT2 丘脑 CSB6B
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 神经病理性疼痛发生过程中脑内VGLUT2表达和功能的变化17-34
• 材料和方法17-24
• 1 实验材料17-18
• 2 实验方法18-24
• 2.1 行为学测试18
• 2.2 坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型18
• 2.3 免疫组织化学实验18-20
• 2.4 谷氨酸囊泡摄取实验20-22
• 2.5 突触体谷氨酸释放实验22-24
• 实验结果24-34
• 1 SNI术后动物痛阈值的变化24
• 2 选取脑区示意图24-25
• 3 SNI术后不同时间点各脑区VGLUT2表达的变化25-30
• 3.1 SNI术后不同时间点丘脑VGLUT2表达的变化25-26
• 3.2 SNI术后不同时间点PAG中VGLUT2表达的变化26-27
• 3.3 SNI术后不同时间点双侧杏仁核中VGLUT2表达的变化27-28
• 3.4 SNI术后不同时间点双侧m PFC中VGLUT2表达的变化28-30
• 4 SNI术后不同时间点丘脑突触囊泡谷氨酸摄取功能的变化30-33
• 5 SNI术后不同时间点小鼠丘脑突触体谷氨酸释放量的变化33-34
• 第二部分 抑制VGLUT2功能对神经病理性疼痛及其他类型疼痛的影响34-56
• 材料和方法34-38
• 1 实验材料34-35
• 2 实验方法35-38
• 2.1 侧脑室置管手术35
• 2.2 化疗药致神经痛模型35
• 2.3 小鼠热板实验35-36
• 2.4 小鼠醋酸扭体实验36
• 2.5 小鼠福尔马林实验36
• 2.6 小鼠转棒实验36
• 2.7 SNI造模及机械痛阈值检测36
• 2.8 免疫组织化学实验36-37
• 2.9 突触体谷氨酸释放实验37
• 2.10 数据统计37-38
• 实验结果38-56
• 1 VGLUT抑制剂（CSB6B）对神经痛疼痛反应的影响38-43
• 1.1 CSB6B腹腔注射在SNI模型不同阶段的作用研究38-39
• 1.2 在SNI模型不同阶段脑室注射VGLUTs抑制剂的作用研究39-42
• 1.3 在化疗药致神经痛模型上脑室注射CSB6B对动物机械痛阈的影响42-43
• 2 CSB6B对动物运动协调性和其他类型疼痛的作用43-48
• 2.1 CSB6B脑室注射对动物运动协调性的影响43-44
• 2.2 CSB6B脑室注射在其他疼痛模型中的作用研究（前期实验结果）44-46
• 2.3 CSB6B腹腔注射在其他疼痛模型中的作用研究46-48
• 3 神经痛过程中CSB6B对c-Fos表达和谷氨酸释放的影响48-56
• 3.1 SNI术后早期不同时间点CSB6B对各脑区c-Fos表达的影响48-53
• 3.2 神经痛过程中CSB6B对突触体谷氨酸释放的影响53-56
• 讨论56-60
• 结论60-61
• 参考文献61-68
• 综述68-73
• 参考文献70-73
• 个人简历73-74
• 致谢74

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