戈登氏菌3-甾酮-Δ 1 -脱氢酶基因定点突变及异源表达

发布时间：2021-04-18 02:53

　　目的:将来源于戈登氏菌（Gordonia neofelifaecis）的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶[3-ketosteroid-Delta（1）-dehydrogenase,KstD]基因通过定点突变并在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶。方法:克隆戈登氏菌KstD基因与表达载体连接构建野生型重组载体p Cold I-KstD;以野生型重组载体为模板,通过反向PCR定点突变构建突变体重组载体pCold I-F307A,把重组载体转入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组子菌株。结果:30℃下诱导表达后获得的重组酶的酶活为85 217.08 U·mg^-1,比野生型提高了2.27倍,酶动力学参数测定结果显示重组酶对雄烯二酮的催化效率比野生型提高了2.32倍。结论:通过定点突变改造野生型3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因,将酶活性催化中心的苯丙氨酸突变为丙氨酸,其对甾体A环C1,2脱氢反应的活性提高。本研究验证了KstD基因的活性位点,为构建高效转化雄烯二酮的基因工程菌奠定了基... 

【文章来源】：中国新药杂志. 2020,29(18)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

目的基因Kst D片段PCR产物电泳结果

提取的p Cold I质粒电泳结果

将野生型重组菌和突变重组菌分别接种于液体培养基中，当A600达到0.8时，加入IPTG诱导表达15 h后收集菌体，超声破碎，利用AKTA纯化目的蛋白，粗酶液经纯化后收集洗脱液中蛋白，用12%的SDS-PAGE电泳检测，电泳结果见图3，重组菌菌液在55 k D处出现目的条带。由此可见BL21/Kst D和BL21/F307 A诱导后表达的蛋白为55.49 k D。证明Kst D蛋白在重组大肠杆菌中能够成功表达。3酶活检测及比酶活的测定

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3144655