利用CRISPR/Cas9技术构建CHO的糖基化酶CMAH和GGTA1基因突变细胞株

发布时间：2021-04-27 08:57

　　研究背景和目的治疗性重组蛋白的生产是生物制药中重要的一部分,而重组糖蛋白用于治疗许多疾病。通常情况下,哺乳动物表达系统是生物制药的首选体系。中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是最常用的哺乳动物细胞系,用其作为宿主,能产生接近人源糖蛋白糖基化的治疗性重组糖蛋白。人源细胞和CHO细胞糖基化最大的不同就是CHO细胞有两个糖基化酶,α-1,3-半乳糖转移酶（α-1,3-Galactosyltransferase,GGTA1）和胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH）,而这两个酶在人体中已经缺失。在用CHO细胞生产治疗性糖蛋白时,GGTA1产生的α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose,α-gal）和CMAH产生的N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）会引起人体的免疫反应。本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CHO细胞进行遗传改造,构建了CMAH和GGTA1基因突变的CHO细胞株,希望改进治疗性重组糖蛋白的治疗安全... 

【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词
前言
材料和方法
    1 材料
        1.1 载体
        1.2 细胞系
        1.3 主要试剂和仪器
    2 实验方法
        2.1 CHO-S细胞CMAH位点Crispr/Cas9系统载体的构建
        2.2 转染HEK293T细胞筛选高效率的切割载体pGL3-U6-CMAH-sgRNA
        2.3 流式分选并获取单克隆细胞
        2.4 CMAH基因定点突变细胞的鉴定
        2.5 GGTA1基因的CRISPR/Cas9系统载体的构建
        2.6 转染HEK293T细胞筛选高效率的切割载体pGL3-U6-GGTA1-sgRNA
        2.7 流式分选并获取单克隆细胞
        2.8 鉴定GGTA1基因是否发生突变
        2.9 细胞功能学实验
        2.10 统计学处理
结果
    1 CMAH基因突变的CHO-S细胞构建成功
        1.1 pGL3-U6-CMAH-sgRNA载体的酶切鉴定结果
        1.2 pmCherry-EGFP-CMAH-Reporter载体的酶切结果
        1.3 筛选出高效的pGL3-U6-CMAH-sgRNA切割载体
        1.4 pGL3-U6-CMAH-sgRNA1、pmCherry-EGFP-CMAH-Reporter和Cas9共转染目的细胞CHO-S细胞的荧光结果
        1.5 CMAH基因突变的CHO-S细胞基因组DNA的PCR产物结果
        1.6 CMAH基因突变的CHO-S细胞基因组RNA的Q-PCR结果
    2 在CMAH基因突变的CHO-S细胞基础上GGTA1基因突变的CHO-S细胞构建成功
        2.1 pGL3-U6-GGTA1-sgRNA载体的酶切鉴定结果
        2.2 pmCherry-EGFP-GGTA1-Reporter载体的酶切结果
        2.3 筛选出高效的pGL3-U6-GGTA1-sgRNA切割载体
        2.4 pGL3-U6-GGTA1-sgRNA1、pmCherry-EGFP-GGTA1-Reporter和Cas9共转染CMAH基因突变的CHO-S细胞的荧光结果图
        2.5 GGTA1基因突变的CHO-S细胞基因组DNA的PCR产物结果
        2.6 GGTA1基因突变的CHO-S细胞基因组RNA的Q-PCR产物结果
    3 细胞功能实验结果
        3.1 细胞增殖实验结果
        3.2 突变株细胞表达外源蛋白的能力
讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献（综述）
个人简历
致谢



本文编号：3163176