醇质体促水溶性药物经皮渗透的机制研究

发布时间：2017-04-20 18:10

  本文关键词：醇质体促水溶性药物经皮渗透的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景皮肤是人体的最大功能器官,皮肤角质层由于其特殊的“砂砖”结构,即角质细胞形成的砖块和角质细胞间神经酰胺、胆固醇、游离脂肪酸组成的砂浆,形成了一道阻碍外部物质进入机体内部的天然屏障。目前临床上许多外用药物均为水溶性药物,如5-氨基酮戊酸、双氯酚酸钠等,即使制备成膏霜、凝胶等剂型,其经皮渗透性仍不够理想,从而使得临床治疗效果大打折扣。为了克服皮肤角质层的屏障作用促进药物进入皮肤深层或血液循环以达到局部或系统治疗的目的,人们采用了多种理化方法,比如化学促渗剂、改变药物结构、微针、离子导入和超声导入等。然而这些理化方法存在一定局限性,如物理方法存在疼痛和费用高等,而化学方法对皮肤存在一定的损伤等。随着材料学和纳米科学的发展,新型经皮药物传递系统(Transdermal Drug Delivery Systems,TDDS)的研发成为解决以上问题的重要途(?)。其中,由磷脂、高浓度短链醇(乙醇,丙二醇)和水组成的醇质体,它作为新型纳米级经皮给药载体,具有热力学性质稳定、包封率高、生物相容性好、促进药物经皮渗透强等特点,而在经皮给药领域里受到了广泛的重视。研究表明醇质体比脂质体具有更强的经皮渗透率,此外,它还能促进水溶性和脂溶性药物,甚至杆菌肽进入细胞内。但是对于醇质体促进药物经皮渗透的机制和醇质体在皮肤内的渗透过程却不清楚。然而,了解醇质体的经皮途(?)和与皮肤相互作用的机制是优化和发展醇质体作为经皮给药载体的前提。激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)可作为研究荧光物质在皮肤内分布的一种光学在体分析的技术,能实现在体实时观察到荧光标记的制剂本身或其承载药物在皮肤各层的分布情况,尤其是在毛囊、皮脂腺和汗腺等附属器等部位,这对于那些直接应用于皮肤各层及其毛囊等附属器的外用药物研发而言不可或缺,此外,能利用相关软件对单位面积内的荧光进行定量赋值和统计学分析,可获得载体经皮渗透量、渗透皮层深度、时间效能、分布和消除规律等数据差异,这也有望建立新型皮肤药代动力学研究方法。本研究以罗丹明8模拟水溶性药物,用NBD-PC标记卵磷脂以示踪磷脂在皮肤中位置；通过制备并筛选罗丹明B醇质体的最佳处方,对其理化性质进行考察;采用CLSM研究罗丹明B醇质体的在体经皮渗透过程及促进水溶性药物经皮渗透的机制;并通过TEM研究醇质体与大鼠皮肤相互作用后超微结构的改变。目的研究醇质体促进水溶性药物经皮渗透的机制及对皮肤超微结构的影响,从而为醇质体经皮制剂的后续研发提供详实的实验数据支撑并奠定坚实的理论基础。方法1、采用正交实验设计L9(34)表制定0.02%罗丹明B醇质体的组方以蛋黄卵磷脂质量分数、无水乙醇的体积分数和超声时间为考察因素,以平均粒(?)值作为衡量指标确定0.02%罗丹明B醇质体最佳处方;2、罗丹明B醇质体、脂质体的制备2.1采用注射超声法制备罗丹明B醇质体：用分析天平称取处方量的蛋黄卵磷脂和罗丹明B。蛋黄卵磷脂置于玻璃瓶中用乙醇溶解,并用磁力搅拌器搅拌均匀,罗丹明B用双蒸水溶解。然后使玻璃瓶与注射器密封连接,允许加入乙醇而避免乙醇挥发。罗丹明B溶解后以200μL·min-1的流速加入卵磷脂乙醇溶液中并以700r·min-1的转速用磁力搅拌器搅拌,药物注入后,再搅拌5min,最后采用探头式超声仪以150W的功率冰水浴条件下超声5min;2.2采用薄膜扩散超声法制备罗丹明B脂质体：精密称取处方量的蛋黄卵磷脂(2%,w/v)并置于圆底烧瓶中,加适量的氯仿溶解,圆底烧瓶连接到旋转蒸发仪上,60℃真空条件下旋转蒸发除去氯仿,直至在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜,真空下过夜以除去残余的氯仿,然后用罗丹明B(0.02%,w/v)水溶液在室温下震荡水化薄膜30min。所得混悬液采用探头式超声仪以150W的功率冰水浴条件下超声5min以均一化粒(?);2.3 NBD-PC标记0.03%罗丹明B醇质体的制备：采用前述方法制备,只是在磷脂中加入处方量的NBD-PC(磷脂与NBD-PC的摩尔比为100：1)；2.4未包封的罗丹明B的分离：使用Amicon Ultra-4(Millipore Corporation, USA)超滤管(截留分子量为3000Da)分离未包封的罗丹明B。取制备的NBD-PC标记的罗丹明B醇质体4mL注入超滤管内,4℃下以12000Xg的离心力离心1h,滤过液丢弃,沉淀管转入一个新的收集管,4℃下以1000Xg的离心力离心5min以获得无游离罗丹明B的NBD-PC标记的罗丹明B醇质体。为了防止荧光淬灭,获得的制剂立即用于皮肤渗透实验;3、采用马尔文粒(?)仪检测罗丹明B醇质体、脂质体的粒(?)及电荷采用马尔文粒(?)仪测定醇质体和脂质体的平均粒(?)和电荷,激光束波长633nm,入射与散射光夹角90。,温度25℃。分别以制备时相同浓度的乙醇溶液和双蒸水稀释醇质体和脂质体至一定浓度后测定,每个样品重复测定三次;4、采用透射电镜观察罗丹明B醇质体的形态罗丹明B醇质体用制备时相同浓度的乙醇溶液稀释后,水浴超声30min。取适量制剂滴于铜网上,并用2%磷钨酸负染,用滤纸吸去多余的染液,用透射电镜在80KV的加速电压下观察粒子形态;5、通过温度和时间的变化来考察0.02%罗丹明B醇质体的稳定性分别将0.02%罗丹明B醇质体存放于4±1℃和25±1℃条件下90d后,采用马尔文粒(?)仪测定0.02%罗丹明B醇质体的粒(?)来评价罗丹明B醇质体的稳定性;6、罗丹明B醇质体的在体经皮渗透采用随机数字表法将SD大鼠随机分为4组(n=6)。在体经皮实验前使用水合氯醛腹腔麻醉大鼠,然后用电动剃毛刀剃去腹部毛发,避免伤及皮肤并用生理盐水清洁皮肤。待腹部皮肤干燥后,用氰基丙烯酸盐粘合剂把面积为0.64cm2的玻璃圆柱粘附在豚鼠腹部皮肤作为给药池,在给药过程中玻璃圆柱保持水平。把200μL的各种制剂加入玻璃圆柱内,使用透明薄膜覆盖以防止蒸发,整个实验过程中严格避光。每组大鼠中的三只分别于设定的1,4,8h时间点采用颈椎脱臼法处死大鼠,用纱布清除多余的制剂,再用生理盐水清洗给药部位皮肤至少3次。接着使用手术刀及剪刀切下给药区域皮肤并剔除皮下脂肪,所取皮肤组织立即用于制作冰冻切片。而每组中的另外三只大鼠在给药8h后,用纱布清除多余的制剂,生理盐水清洗给药皮肤至少3次。并在清除药物后的1,4,8h时间点采用颈椎脱臼法处理大鼠,并以相同的方法处理给药部位皮肤;7、醇质体促进水溶性药物的经皮渗透机制研究采用随机数字表法将SD大鼠随机分为三组(n=3)。在体经皮实验前使用水合氯醛腹腔麻醉大鼠,然后用电动剃毛刀剃去腹部毛发,避免伤及皮肤并用生理盐水清洁皮肤。待腹部皮肤干燥后,用氰基丙烯酸盐粘合剂把面积为0.64cm2的玻璃圆柱粘附在豚鼠腹部皮肤作为给药池,在给药过程中圆柱保持水平。把200μL的NBD-PC标记罗丹明B醇质体加入玻璃圆柱内,使用透明薄膜覆盖以防止蒸发,整个实验过程中严格避光。分别于设定的1,4,8h时间点采用颈椎脱臼法处死大鼠,用纱布清除多余的制剂,再用生理盐水清洗给药部位皮肤至少3次。接着使用手术刀取下给药区域皮肤并剔除皮下脂肪,所取皮肤组织立即用于制作冰冻切片;8、皮肤组织冰冻切片的制备采用冰冻切片结合CLSM分析技术来观察各制剂透皮后各荧光素在皮肤内各层的分布。把各时间点取下的皮肤标本放在冰冻切片机的样品托上,加适量OCT于-20℃温度下对样品进行冷冻。切片厚度为8μm,用防脱载玻片贴片,无水甘油封片。及时用CLSM观察各荧光素在皮肤内的分布;9、皮肤组织超薄切片制备使用TEM观察给药部位皮肤的超微结构的改变,并以正常皮肤作对照。皮肤标本切成2×4mm2大小,2.5%的戊二醛4℃下固定过夜,1%的四氧化锇固定2h,然后用(35%,50%,70%,95%,和100%)的梯度酒精脱水,最后树脂包埋并在70℃下孵育8h。使用超薄切片机切片,切片置于铜网上,然后使用醋酸铀和柠檬酸铅负染,采用TEM观察拍照；10、激光共聚焦显微镜扫瞄皮肤组织冰冻切片各时间点组织切片内荧光素的分布采用CLSM进行观察。CLSM的各项参数在扫描中保持一致,罗丹明B用波长为568nm的氪激光激发,发射荧光为红色,NBD-PC用波长为488nm的氩激光激光,发射的荧光为绿色,物镜为30倍。各切片的平均荧光强度及荧光面积使用Image-Pro Plus软件进行分析,然后对平均荧光强度及平均荧光面积作时间图。同时对各荧光图像进行皮肤自身荧光校正;11、数据统计与分析采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析。两样本均数间的比较用T检验,多组样本均数之间的比较：当满足方差齐性时,使用单向方差分析和样本均数间的多重比较(LSD法);当不满足方差齐性时使用近似F检验(Welch检验方法)及校正的多重比较方法(Dunnett's T3)。并使用Origin 7.5绘制统计图。当P0.05时视为具有显著的统计学差异。结果中数据以X±S表示;结果1、根据正交试验设计结果,确定0.02%罗丹明B醇质体的最佳处方为：35%(v/v)无水乙醇,2%(wN)蛋黄卵磷脂,0.02%(w/v)罗丹明B；影响罗丹明B醇质体粒(?)的主次因素顺序为：无水乙醇浓度蛋黄卵磷脂浓度超声时间;根据最佳处方制备的罗丹明B醇质体的粒(?)为：113.5±2.3nm(n=3)；2、透射电镜(TEM)观察0.02%罗丹明B醇质体的形态为大小较为均一的圆形小球;3、马尔文动态激光粒度仪(Malvem)测得0.02%罗丹明B醇质体的大小为：113.5±2.3nm(n=3),多分散指数(PDI)为0.132±0.035(n=3),电荷为-19.5±2.3mV(n=3)：4、将0.02%罗丹明B醇质体保存于不同温度并于90d之后测定其粒(?),结果显示：醇质体在4±1℃条件下的粒(?)发生了显著性变化(P=0.000),但在25±1。C条件下,罗丹明B醇质体的粒(?)变化不显著(P=0.126);5、平均荧光面积和强度代表各种制剂进入皮肤内的深度和量。制剂经皮渗透1h后,罗丹明B醇质体组可见在角质层和浅层毛囊有较明亮的红色荧光。罗丹明B醇质体组的平均荧光面积和平均荧光强度与罗丹明B脂质体、醇水溶液、水溶液相比具有显著差异性(P=0.000),但罗丹明B脂质体与罗丹明B醇水溶液平均荧光面积(P=0.908)和平均荧光强度(P=0.863)均无统计学差异。4h后罗丹明B醇质体组红色荧光分布在深层毛囊及真皮深层。罗丹明B醇质体与其余制剂的荧光面积和平均荧光强度比较具有统计学差异(P=0.000),罗丹明B脂质体与醇水溶液的平均荧光面积(P=0.002)和平均荧光密度(P=0.001)亦有统计学差异。8h时罗丹明B醇质体在真皮深层的红色荧光亮度更强。醇质体与其余制剂的荧光面积和平均荧光强度比较具有统计学差异(P=0.000)。各种制剂经皮给药8h后去除皮肤表面多余的制剂后皮肤内荧光逐渐减弱,去除药物1h后罗丹明B醇质体组可见红色荧光分布在角质层、真皮浅层、毛囊内,真皮深层无红色荧光。醇质体与脂质体(P=0.000)、醇水溶液(P=0.001)、水溶液(P=0.000)的平均荧光面积相比有显著统计学差异,平均荧光强度亦有统计学差异(P=0.000)。4h后罗丹明B醇质体在浅层毛囊和角质层可见明亮红色荧光,醇质体与与脂质体(P=0.000)、醇水溶液(P=0.002)、水溶液(P=0.000)的平均荧光面积相比有显著统计学差异,平均荧光强度亦有统计学差异(P=0.000)。8h时罗丹明B醇质体在角质层可见少量红色荧光分布,醇质体与其余制剂的平均荧光面积相比有显著统计学差异(P=0.000),与脂质体(P=0.000)、醇水溶液(P=0.002)、水溶液(P=0.000)的平均荧光强度相比亦有统计学差异;6、使用CLSM观察罗丹明B和NBD-PC在皮肤内的分布情况。制剂经皮1h时皮肤浅层毛囊内可见明亮绿色荧光,且毛干内充满绿色荧光,而皮肤角质层的绿色荧光很弱；红色荧光在角质层成较暗的带状分布,皮肤浅层毛囊亦有较弱红色荧光分布,但毛干中央未见红色荧光。4h时在皮肤深层的毛囊可见绿色荧光分布,角质层的绿色荧光较强且呈带状分布,此时红色荧光在角质层呈明亮的带状分布,皮肤浅层毛囊的红色荧光逐渐增强,皮肤深层的毛囊也开始出现红色荧光。8h时绿色荧光依然分布在角质层和毛囊内,但红色荧光除了分布在角质层和毛囊外,在活性表皮层亦可见分布,而在真皮层分布不明显；7、采用TEM研究NBD-PC标记罗丹明B醇质体与皮肤相互作用后皮肤超微结构的改变。由正常对照皮肤的TEM图像可知,皮肤角质层结构紧密,角质细胞扁平,活性表皮层可见桥粒分布,基底膜带结构完整,可见清晰的半桥粒。NBD-PC标记罗丹明B醇质体在大鼠腹部皮肤经皮应用4h的电镜图显示：角质细胞肿胀变大,角质桥粒断裂导致角质层整体结构疏松,角质细胞间间隙明显增宽,角质层不同深度均可见完整的脂质囊泡,部分囊泡崩解破裂成脂质碎片分布在角质细胞间,角质层深层的疏松度较浅层明下降,颗粒层结构未见改变,细胞间桥粒完整,未见脂质囊泡和脂质碎片分布,真皮乳头层基底膜结构完整,未见半桥粒破坏;结论1、0.02%的罗丹明B醇质体为大小较为均一的圆形小球,粒(?)小,分散指数小,带负电荷,在25±1℃下保存稳定性好；2、在体经皮渗透试验结果表明：醇质体的在体经皮渗透时滞短,其在皮肤内的渗透深度及渗透量均显著高于脂质体、醇水溶液和水溶液。醇质体在皮肤内的储留时间长于脂质体、醇水溶液、水溶液;3、醇质体经皮给药时一部分囊泡迅速分布至毛囊区,且由毛囊浅层向深层及毛囊周围渗透,其余的醇质体则通过角质细胞间进入角质层;4、醇质体在经皮给药时能以完整的载体形式进入角质层和毛囊内,然后在角质层和毛囊内与脂质相互作用发生崩解,崩解后的磷脂停留在角质层和毛囊区充当促渗剂的作用,而不向活性表皮层及真皮层渗透,此后,醇质体所携带的药物独自进入活性表皮层和真皮层。同时醇质体在角质层表面形成的脂质膜还具有封包作用。
【关键词】：醇质体 经皮渗透 在体 激光共聚焦显微镜
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 前言22-29
• 参考文献25-29
• 第一部分 罗丹明B醇质体的组方及质控研究29-38
• 1.1 仪器与材料29
• 1.2 实验方法29-31
• 1.3 实验结果31-33
• 1.4 讨论33-36
• 1.5 参考文献36-38
• 第二部分 罗丹明B醇质体的在体经皮渗透性研究38-50
• 2.1 仪器与材料38-39
• 2.2 实验方法39-40
• 2.3 实验结果40-46
• 2.4 讨论46-48
• 2.5 参考文献48-50
• 第三部分 醇质体促进水溶性药物经皮渗透的机制研究50-61
• 3.1 仪器与材料50-51
• 3.2 实验方法51-52
• 3.3 实验结果52-56
• 3.4 讨论56-59
• 3.5 参考文献59-61
• 全文总结61-63
• 综述63-71
• 参考文献68-71
• 英文缩写词对照表71-72
• 攻读学位期间成果72-73
• 致谢73-74

【共引文献】

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1 唐敏;双氯芬酸钠微囊化及其缓释制剂的研究[D];河南大学;2014年

  本文关键词：醇质体促水溶性药物经皮渗透的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：319243