Ht-31多肽抑制慢性炎性疼痛的分子机制

发布时间：2017-04-24 18:03

  本文关键词：Ht-31多肽抑制慢性炎性疼痛的分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：蛋白激酶A (Protein kinase A; PKA),也称cAMP依赖性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase),通过催化N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型谷氨酸受体(N-methyl-D-aspartate-subtype glutamate receptor; NMDAR)等离子通道的磷酸化,在突触可塑性中发挥着重要作用。PKA对底物的催化效率与特异性,严格取决于其在细胞中的分布与定位。A激酶锚定蛋白(A kinase anchoring proteins; AKAPs)作为PKA的一种锚定蛋白,可结合PKA并携带PKA靠近底物。现已知PKA可增强NMDA受体的功能、参与中枢敏感化过程,但对其锚定蛋白AKAPs在此过程中所起的作用,至今尚不清楚。本研究将采用能特异性打断AKAPs-PKA复合物的、链接硬脂酸盐(stearate; St)的St-Ht31多肽(St-N-DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAYC),探讨AKAPs锚定的PKA在脊髓背角NMDA受体介导的痛觉信息传递中的作用及其分子调控机制。方法：小鼠足底皮下注射完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant; CFA)建立慢性炎性疼痛模型,结合行为学测试、电生理膜片钳技术以及免疫印迹等实验方法,深入探讨打断AKAPs与PKA的结合对慢性炎性疼痛的影响及其分子机制。结果：(1)CFA炎性疼痛小鼠鞘内给予St-Ht31多肽,可剂量依赖性地缓解慢性炎性疼痛,而其链接硬脂酸盐的对照多肽链St-Ht31p (St-N-DLIEEAASRPVDAVPEQVKAAGAYC)却无此作用；(2)电生理结果显示：CFA可显著增加脊髓背角NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents; EPSCs)的幅值,并显著降低a-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic Acid (AMPA)型谷氨酸受体(AMPAR)与NMDA受体介导的EPSCs幅值比(AMPAR/NMDAR ratios), CFA的这种作用可被St-Ht31(50.0μM)所抑制,提示：St-Ht31可抑制CFA动物NMDA受体介导的痛觉突触传递；(3)St-Ht31(50.0μM)预处理CFA小鼠离体脊髓片,可有效阻断GluN2B-NMDA受体选择性阻断剂ifenprodil(3.0μM)对NMDAR-EPSCs的下调作用,说明St-Ht31的作用靶点可能是包含GluN2B亚基的NMDA受体(GluN2B-NMDA受体)。与此结果一致,鞘内给予St-Ht31(7.0μg)也能有效抑制CFA引发的脊髓背角GluN2B-NMDA受体的突触表达亢进。这些结果提示：St-Ht31的突触抑制作用与降低GluN2B-NMDA受体的突触数量密切相关；(4)电极内液中加入PKA激动剂8-Br-cAMP(100.0μM),可显著增强正常小鼠脊髓背角NMDAR-EPSCs的幅值,而8-Br-cAMP的这种作用可被Microtubule解聚剂nocodazole(10.0μM)预处理所抑制。不仅如此,用nocodazole预处理脊髓片,也可有效阻断St-Ht31对CFA小鼠NMDAR-EPSCs的抑制作用。提示：St-Ht31可通过抑制NMDA受体沿Microtubule的转运过程,减少NMDA受体的突触数量；(5)Dynamin抑制剂dynasore(80.0μM)对CFA小鼠的NMDAR-EPSCs幅值并不产生明显影响,但可以有效阻断St-Ht31对炎性小鼠NMDAR-EPSCs的抑制作用。提示：St-Ht31(50.0μM)可通过诱导NMDA受体的内陷过程,减少NMDA受体的突触数量；(6)小鼠足底皮下注射CFA后1天,脊髓背角cofilin蛋白第3位丝氨酸(cofilin-Ser3)的磷酸化水平显著升高,而鞘内注射St-Ht31(7.0μg)可抑制这种由CFA诱发的cofilin-Ser3的磷酸化。电极内液中加入F-actin稳定剂phalloidin(100.0μM)并不影响CFA小鼠脊髓背角NMDAR-EPSCs,但事先用phalloidin(100.0μM)预处理脊髓片可明显阻断St-Ht31对NMDAR-EPSCs的抑制作用。这些结果提示：St-Ht31也可通过干扰F-actin,减少NMDA受体的突触数量,从而抑制NMDA受体介导的突触传递。结论：St-Ht31多肽链可能通过干扰NMDA受体的Microtubule运输、dynamin依赖性受体内陷以及F-actin介导的膜稳定等多个环节,降低NMDA受体的突触数量,抑制NMDA受体介导的痛觉突触传递,缓解慢性炎性疼痛。
【关键词】：炎性疼痛 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型谷氨酸受体 脊髓背角 A激酶锚定蛋白 cAMP依赖性蛋白激酶 St-Ht31
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-18
• 1.1 NMDA受体的结构与功能10-11
• 1.2 NMDA受体的转运过程11-12
• 1.3 PKA及其锚定蛋白AKAPs12-14
• 1.4 PKA对NMDA受体的调节作用14
• 1.5 Microtubule与NMDA受体转运14-16
• 1.6 F-actin对NMDA受体的调节作用16-17
• 1.7 假设17-18
• 第二章 实验材料和方法18-27
• 2.1 实验材料18-23
• 2.1.1 实验动物18
• 2.1.2 实验仪器与器材18-19
• 2.1.3 实验试剂(Reagents)19-20
• 2.1.4 实验溶液(Experimental solution)20-23
• 2.2 实验方法与步骤23-27
• 2.2.1 慢性炎性疼痛模型的建立23
• 2.2.2 鞘内给药23
• 2.2.3 行为学测试23-24
• 2.2.4 脊髓切片的制备24
• 2.2.5 电生理记录24-25
• 2.2.6 亚细胞结构的分离25-26
• 2.2.7 Western免疫印迹(Western Blot)26
• 2.2.8 统计分析26-27
• 第三章 实验结果27-46
• 3.1 鞘内注射St-Ht31多肽抑制慢性炎性疼痛27-28
• 3.2 St-Ht31抑制疼痛小鼠脊髓背角NMDA受体介导的突触传递28-31
• 3.3 St-Ht31抑制炎性小鼠脊髓背角GluN2B-NMDA受体介导的突触传递和突触表达31-35
• 3.3.1 St-Ht31有效阻断ifenprodil对炎性小鼠NMDAR-EPSCs的抑制作用31
• 3.3.2 St-Ht31显著抑制GluN2B-NMDA受体介导的突触表达31-35
• 3.4 St-Ht31抑制NMDAR沿Microtubule的转运过程35-40
• 3.4.1 Microtubule在PKA增强NMDA受体介导的突触传递中的作用35-37
• 3.4.2 Microtubule在CFA增强NMDA受体介导的突触传递中的作用37-40
• 3.5 St-Ht31调节NMDA受体的内陷过程40-42
• 3.6 St-Ht31干扰F-actin对突触NMDA受体的膜稳定作用42-46
• 3.6.1 Phalloidin有效阻断St-Ht31对CFA小鼠NMDAR-EPSCs的抑制作用42-44
• 3.6.2 St-Ht31通过cofilin影响F-actin介导的NMDA受体膜稳定44-46
• 第四章 讨论46-48
• 第五章 结论与展望48-49
• 5.1 结论48
• 5.2 展望48-49
• 参考文献49-54
• 缩略词54-56
• 在学期间的研究成果56-57
• 致谢57

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本文编号：324673