锌离子对于内含肽Npu自剪接的抑制调控及分子间二硫键对其突变体C-末端剪切效率的影响

发布时间：2021-06-24 20:18

　　背景及目的:内含肽作为一种可以介导自身从前体蛋白质中自我切除,同时将内含肽两侧的外显肽蛋白通过肽键连接起来的功能性蛋白质,在过去的十几年中迅速地被人们所认知和利用。随着对内含肽剪接机制研究的逐步深入,人们对内含肽的应用也越来越广泛。如,内含肽在蛋白质的纯化过程中与标签连用的应用,内含肽的自我断裂可以很容易地将标签从纯化体系中去除,避免了通过蛋白酶等方法去除标签对目的蛋白的影响,具有很大的应用价值和发展前景;在蛋白质连接过程中,内含肽介导的蛋白质连接技术也广泛地应用于蛋白质工程以及双效特异性抗体的研究中;此外还在基因诊断治疗,生物传感器等方面均有很广泛的应用。早期应用的内含肽多为连续型内含肽,如Sce VMA,mini-Mtu RecA,Ssp DnaB等。他们在蛋白质的纯化连接过程中作出很多贡献,但是,连续型内含肽在纯化过程中极容易提前自我断裂,而且反应速率较慢,时间较长。而后人工断裂Ssp DnaB被人们发现和利用,将内含肽的两片段分开表达大大降低了内含肽提前自我断裂的可能性。Npu DnaE是一种天然的断裂型的内含肽。将内含肽的两片段分别融合纯化标签和目的蛋白,在蛋白质纯化过程中很... 

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内含肽的结构模式图

图 1-2 内含肽四步剪接反应机理Fig.1-2 Mechanism of intein splicing.第一步：内含肽与 N 末端外显肽通过肽键相连接，内含肽 N 末端的巯基对这个肽键进行亲核进攻，通过 N-O 或 N-S 基团发生重排，使得肽键发生迁移后形成一个线性的酯键，N 端外显肽结合到丝氨酸／苏氨酸的氧原子或半胱氨酸的硫原子上。第二步：N 末端外显肽通过酯基迁移作用，从内含肽第一个氨基酸残基迁移到了 C 末端外显肽的第一位氨基酸残基上。第三步：内含肽 C 末端保守的天冬氨酸环化，伴随着肽键的断裂，使得内含肽和外显肽发生分离。第四步：巯基再一次对肽键进行亲核进攻，使得两个外显肽经过重排的作用

上海交通大学硕士学位论文2 mM Zn2+，在 25℃，180rpm 的条件下诱导过夜。离心（5000g，5min）收集菌体后用 ICP 测量细胞内锌离子浓度。2.3 实验结果 2.3.1 单独表达 pBad-HisA /Fc-NpuN 重组蛋白及锌离子容忍度对上述加入了 1mM~2.5mM 锌离子的大肠杆菌取相同菌体量进行 SDS-PAGE 和 Western-Blot 分析，结果如图 3.1。kD


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