蛋白质O-GlcNAc糖基化在紫杉醇抗肿瘤活性中的作用研究

发布时间：2017-04-24 20:10

  本文关键词：蛋白质O-GlcNAc糖基化在紫杉醇抗肿瘤活性中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：O-GlcNAc糖基化修饰是指单个的N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)以O-糖苷键连接在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟基的氧原子上。美国生物化学家Gerald W. Hart教授课题组1984年首次发现蛋白质的O-GlcNAc单糖基化修饰现象。近30年的研究发现,O-GlcNAc糖基化广泛参与基因转录、蛋白翻译及加工、信号传导、细胞应激反应等细胞内生命活动的调控。O-GlcNAc糖基化的异常修饰可以导致多种疾病,比如肿瘤、糖尿病及多种神经退行性疾病等的发生。而我们在研究紫杉醇抗肿瘤过程中发现蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平发生明显的改变而且变化呈现一定的规律性。因此,本论文研究蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰在紫杉醇抗肿瘤活性中的作用。本课题主要通过体内和体外实验,从动物组织和细胞水平上分析紫杉醇对蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰水平的影响,通过运用OGA和OGT的抑制剂研究O-GlcNAc糖基化变化对紫杉醇抗肿瘤活性的影响,并通过对O-GlcNAc糖基化生物合成途径中的相关酶的影响来分析探讨其机制。此外,本课题还通过质谱分析的方法对糖酵解过程中两个关键酶己糖激酶2型(HK2)和丙酮酸激酶M2型(PKM2)的O-GlcNAc糖基化位点进行了鉴定,运用细胞稳定转染方法构建HK2和PKM2基因稳定高表达细胞株,构建HK2和PKM2基因沉默的乳腺癌MDA-MB-231细胞株,为进一步深入研究O-GlcNAc糖基化修饰的功能作用奠定基础。在体外细胞实验中,通过Western blotting方法检测不同浓度的紫杉醇对乳腺癌MDA-MB-231细胞中蛋白质O-GlcNAc糖基化及相关蛋白酶的表达水平,发现蛋白质O-GlcNAc糖基化、OGA及OGT的表达水平随着紫杉醇浓度的升高而升高,具有浓度依赖性关系,而相关的蛋白酶PFK1、HK2、PKM2、GFAT1和GLUT1表达水平无明显变化；通过RT-qPCR法检测发现OGT和OGA的mRNA表达水平也随着紫杉醇浓度的增加而升高,具有浓度依赖性关系。Western blotting法检测紫杉醇处理MDA-MB-231细胞在不同时间点的蛋白质O-GlcNAc糖基化及相关蛋白酶的表达水平,发现蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰、OGA、OGT的表达水平随着紫杉醇作用时间的增加而升高而且呈现时间依赖性,而相关的蛋白酶PFK1、PKM2、GFAT1和GLUT1表达水平无明显变化。磺酰罗丹明B (sulforhodamine B, SRB)比色法测定OGA抑制剂TMG或PUGNAc单独或联合紫杉醇对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增值抑制作用,实验结果表明TMG及PUGNAc对乳腺癌细胞MDA-MB-231无显著的增值抑制作用,TMG或PUGNAc与紫杉醇联合使用对细胞的增值抑制作用与紫杉醇单独处理组无明显的差异；Western blotting研究发现TMG或P UGNAc实验组O-GlcNAc糖基化水平比对照组高,TMG或PUGNAc与紫杉醇联合用药组的O-GlcNAc糖基化水平比紫杉醇单独给药组高,但OGT的表达水平却无明显变化规律。由TMG或PUGNAc对紫杉醇的细胞增殖抑制实验结果表明TMG或PUGNAc所引起的O-GlcNAc糖基化水平的增高不影响紫杉醇对细胞的增殖抑制作用。OGT的抑制剂alloxan与紫杉醇单独或联合处理MDA-MB-231细胞时,SRB结果显不alloxan浓度为0-5 mM时对乳腺癌细胞MDA-MB-231无明显的增殖抑制作用,alloxan与紫杉醇联合使用组对细胞的增值抑制作用与紫杉醇单独加药组相比无明显差异；Western blotting检测发现alloxan处理组的O-GlcNAc糖基化水平降低,而OGA和OGT表达水平无明显的变化。由alloxan对紫杉醇的细胞增殖抑制作用实验结果表明alloxan所引起的O-GlcNAc糖基化水平的降低不影响紫杉醇对细胞的增值抑制作用。经Western blotting方法检测紫杉醇对OGA和OGT表达分布的影响,发现紫杉醇作用下细胞质内OGA和OGT的表达水平明显增高。本课题还通过检测紫杉醇处理p53野生型HCT116细胞和p53基因敲除的HCT116细胞,发现p53基因的缺失导致蛋白质糖基化水平升高,并且发现p53参与紫杉醇诱导的蛋白质O-GlcNAc糖基化改变。为进一步研究紫杉醇对蛋白质O-GlcNAc糖基化水平影响机制奠定了基础。在体内荷瘤裸鼠实验中,通过Western blotting方法检测肿瘤组织及肝脏组织中蛋白质O-GlcNAc糖基化及OGA和OGT的表达水平,结果发现在给药剂量下紫杉醇没有影响肿瘤组织和肝脏组织中O-GlcNAc糖基化、OGA和OGT的表达水平。为了深入研究紫杉醇对蛋白质O-GlcNAc的影响机制,我们还进行了糖酵解途径中的关键酶HK2和PKM2的糖基化位点鉴定等相关工作。本课题通过细胞转染和免疫共沉淀的方法富集HK2和PKM2蛋白,之后通过胶内酶解等方法进行预处理之后,经质谱方法分析鉴定了其O-GlcNAc糖基化位点。结果在蛋白质HK2检测到3个O-GlcNAc糖基化信号,而PKM2蛋白上检测到16个O-GlcNAc糖基化信号。为之后进行O-GlcNAc糖基化修饰的功能研究奠定了基础。本课题通过Lipofectamin2000将HK2和PKM2的真核表达载体转染至乳腺癌细胞MDA-MB-231,然后经过有限稀释法加药筛选出HK2和PKM2基因稳定高表达的单克隆细胞株；首先运用shRNA干扰技术设计干扰HK2和PKM2基因的干扰片段,然后分别将含干扰HK2和PKM2基因的shRNA慢病毒颗粒感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过加药筛选出了HK2和PKM2基因沉默的细胞株。综上所述,现已初步研究了体内和体外试验中紫杉醇在抗肿瘤活性中对蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的影响及其机制。本论文发现紫杉醇可以诱导蛋白质O-GlcNAc糖基化水平升高,并初步探讨了其机制；蛋白质O-GlcNAc糖基化水平的改变没有影响紫杉醇的细胞增殖抑制活性；检测出了PKM2和HK2的O-GlcNAc糖基化位点,而且还成功构建了HK2和PKM2基因高表达和基因沉默的系列细胞株。这些工作为进一步研究O-GlcNAc糖基化修饰在抗肿瘤过程中的功能奠定了基础。
【关键词】：O-GlcNAc糖基化 己糖激酶(HK2) 丙酮酸激酶M2型(PKM2) 紫杉醇 肿瘤
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 符号说明16-18
• 第一章 前言18-28
• 1 蛋白质的O-GlcNAc糖基化18-26
• 1.1 蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰过程的相关调节酶19-21
• 1.2 O-GlcNAc糖基化修饰的供体UDP-GlcNAc21-22
• 1.3 蛋白质O-GlcNAc糖基化与糖酵解22-23
• 1.4 蛋白质O-GlcNAc糖基化与抑癌基因p5323-24
• 1.5 蛋白质O-GlcNAc糖基化位点的检测24-25
• 1.6 蛋白质的糖基化与药物的抗肿瘤作用的相互影响25-26
• 2 紫杉醇的研究现状26-27
• 3 本课题的研究意义27
• 4 本课题拟解决的问题27-28
• 第二章 紫杉醇抗肿瘤细胞增殖作用和蛋白质O-GlcNAc糖基化水平的相互关系28-57
• 1 实验材料28-30
• 1.1 细胞株28
• 1.2 主要试剂28-30
• 2 仪器设备30
• 3 实验方法及步骤30-39
• 3.1 紫杉醇对乳腺癌细胞MDA-MB-231中蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响30-33
• 3.2 紫杉醇对乳腺癌细胞MDA-MB-231中OGA、OGT的mRNA水平的影响33-36
• 3.3 OGA的抑制剂对紫杉醇抗肿瘤作用的影响36-37
• 3.4 OGT的抑制剂对紫杉醇抗肿瘤作用的影响37-38
• 3.5 紫杉醇对OGT或OGA的细胞内分布的影响38-39
• 3.6 p53基因对蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响39
• 4 实验结果39-54
• 4.1 紫杉醇对乳腺癌细胞MDA-MB-231中蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响39-44
• 4.2 紫杉醇对乳腺癌细胞OGA、OGT的mRNA水平的影响44-45
• 4.3 OGA抑制剂对紫杉醇抗细胞增殖作用的影响45-50
• 4.4 OGT抑制剂对紫杉醇抗细胞增殖作用的影响50-52
• 4.5 紫杉醇对OGT或OGA在细胞内分布的影响52-53
• 4.6 p53基因对蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响53-54
• 5 讨论54-57
• 第三章 在荷瘤裸鼠中紫杉醇对蛋白质O-GlcNAc糖基化水平的影响57-67
• 1 实验材料57-58
• 1.1 细胞株57
• 1.2 实验动物57
• 1.3 主要试剂57-58
• 1.4 病毒颗粒58
• 2 仪器设备58
• 3 实验方法及步骤58-60
• 3.1 MDA-MB-231/GFP细胞株的构建58-59
• 3.2 在裸鼠体内紫杉醇对蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响59-60
• 4 实验结果60-66
• 4.1 MDA-MB 231/GFP细胞株的构建60-63
• 4.2 在裸鼠体内紫杉醇对蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响63-66
• 5 讨论66-67
• 第四章 丙酮酸激酶M2型(PKM2)及己糖激酶(HK2)的O-GlcNAc糖基化位点的鉴定及相关细胞株的构建67-85
• 1 实验材料67-68
• 1.1 细胞株及菌株67
• 1.2 生化试剂67-68
• 2 仪器设备68
• 3 实验方法及步骤68-77
• 3.1 PKM2和HK2的O-GlcNAc糖基化位点的鉴定68-71
• 3.2 稳定高表达PKM2的单克隆细胞株的构建71-73
• 3.3 内源性PKM2基因沉默细胞株的构建73-74
• 3.4 稳定高表达HK2的单克隆细胞株的构建74-76
• 3.5 内源性HK2基因沉默细胞株的构建76-77
• 4 实验结果77-83
• 4.1 PKM2和HK2的O-GlcNAc糖基化位点的鉴定77-79
• 4.2 稳定高表达PKM2单克隆细胞株的构建79-81
• 4.3 内源性PKM2基因沉默细胞株的构建81
• 4.4 稳定高表达HK2单克隆细胞株的构建81-82
• 4.5 内源性HK2基因沉默细胞株的构建82-83
• 5 讨论83-85
• 全文结论85-86
• 参考文献86-93
• 致谢93-94
• 攻读硕士期间发表的论文94-95
• 附件95

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