Smad2通过抑制TGF-β1/Smad3介导的胶原合成在肝纤维化中起保护作用

发布时间：2021-07-01 08:35

　　肝纤维化（fibrosis of liver）是由各种慢性肝病发展到肝硬化、肝癌的中间必经阶段,主要表现为细胞外基质（extracelluar matrix,ECM）在肝内的大量沉积,并由此导致肝脏功能损伤。其中胶原是ECM的主要来源是,抑制胶原的合成能够减慢肝纤维化的发生和发展。TGF-β1是公认的调控肝纤维化形成的因子,在肝纤维化疾病过程中,TGF-β1激活HSC,促使ECM产生,同时会抑制基质金属蛋白酶,使胶原降解减少,逐渐加重肝纤维化。Smad2和Smad3作为TGF-β信号下传的主要效应分子,结构上相似,但功能呈多样化。在肝纤维化中,Smad3是致病性的,而Smad2所扮演的具体角色还不确定。本研究采用皮下注射50%CCl4植物油溶液（1ml/kg）12周建立大鼠肝纤维化模型,TGF-β1刺激人肝星状细胞株LX-2为细胞模型,采用激光共聚焦、分子生物学、明胶酶谱等手段检测肝纤维化病程中Smad2和Smad3的表达变化。（1）Smad2和Smad3在肝星状细胞中表达采用CCl4皮下注射SD大鼠12周,复制模型。HE和Masson染色结果显示模型组大鼠肝组织出现肝纤维化的病理变化... 

【文章来源】：安徽医科大学安徽省

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
1 前言
2 实验材料
    2.1 实验动物与细胞
    2.2 药品与试剂
    2.3 仪器与设备
3 实验方法
    3.1 CCl4 诱导大鼠肝纤维化模型
    3.2 肝脏病理学检测
        3.2.1 HE染色
        3.2.2 Masson染色
    3.3 人肝星状细胞LX-2 培养
    3.4 Smad2-si RNA, Smad3-si RNA转染LX-2
        3.4.1 si RNA设计原则
        3.4.2 实验分组及时间点
        3.4.3 转染
    3.5 质粒提取
        3.5.1 LB培养基的配制
        3.5.2 质粒提取
    3.6 Smad2,Smad3过表达质粒干扰实验
    3.7 肝脏组织/LX-2细胞总RNA的提取(Trizol法)和逆转录
        3.7.1 组织/细胞总RNA提取
        3.7.2 总RNA定量
        3.7.3 逆转录过程(c DNA的合成)
    3.8 PCR扩增
        3.8.1 引物序列
        3.8.2 Real-time PCR
    3.9 Western blot试验
        3.9.1 用液的配制
        3.9.2 蛋白样品制备
        3.9.3 BCA法蛋白定量
        3.9.4 SDS-PAGE电泳
    3.10 免疫荧光
    3.11 明胶酶谱试验
        3.11.1 操作原理
        3.11.2 操作步骤
    3.12 统计学处理
4 结果
    4.1 Smad2 和Smad3 在肝星状细胞中表达
        4.1.1 模型组大鼠肝组织病理变化
        4.1.2 Col.I的变化
        4.1.3 p-Smad2 和p-Smad3 在肝星状细胞表达
    4.2 沉默Smad2、Smad3 基因后,胶原沉积的变化
        4.2.1 小干扰RNA技术沉默Smad2 和Smad3
        4.2.2 沉默Smad2,Smad3 后,Col.I表达变化
    4.3 过表达Smad2、Smad3 后,胶原沉积的变化
        4.3.1 质粒过表达Smad2,Smad3
        4.3.2 过表达Smad2,Smad3 后,Col.I表达变化
    4.4 沉默Smad2、Smad3 后,胶原降解的变化
        4.4.1 沉默Smad2,基质降解不平衡
        4.4.2 明胶酶谱检测MMP-2 酶的活性
    4.5 过表达Smad2、Smad3 后,胶原降解的变化
        4.5.1 过表达Smad2 基因,基质的降解不平衡
        4.5.2 明胶酶谱检测MMP-2 酶的活性
    4.6 Smad2 抑制纤维化的机制研究
        4.6.1 沉默Smad2 后P- Smad3 的核转位增加
        4.6.2P-Smad3 总与Smad2 呈相反的表达趋势
5 讨论
6 结论
参考文献
附录
致谢
综述
    参考文献



本文编号：3258806