熊果酸经SFRP4/Wnt/β-catenin/Foxo3a/p27通路调控血管平滑肌细胞增殖

发布时间：2021-07-07 10:30

　　目的:从SFRP4/Wnt/β-catenin/Fox O3a/p27通路的角度,研究熊果酸（UA）对AngⅡ诱导A7r5细胞增殖的抑制作用。方法:复制SD大鼠高脂血症模型,免疫组化技术检测其胸主动脉壁SFRP4的蛋白表达;复制AngⅡ（0.1μM）诱导的A7r5细胞增殖模型,实验分组为:正常对照组,AngⅡ模型组,UA组（5μM,10μM,20μM）,UA组均预给药12h后加入AngⅡ造模24h,CCK-8法检测该时间点细胞增殖活性;RT-PCR和western blot技术检测各组细胞SFRP4、β-catenin、Fox O3a、p27的m RNA和蛋白水平;免疫荧光技术观测β-catenin的胞内定位;首次应用RNA干扰技术,验证A7r5细胞通路级联关系及UA的作用靶标,设计分组:AngⅡ模型组、模型+si-SFRP4组、模型+Wnt通路抑制剂XAV939（5μM,预孵育4h）组、UA组（20μM）、UA+si-SFRP4组、UA+Wnt通路激活剂Li Cl（500μM,预孵育4h）组;Western blot技术检测干扰效率和目的蛋白表达;采用SPSS 17.0对数据进行统计... 

【文章来源】：青岛大学山东省

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略词表
引言
第一章 实验材料
    1.1 受试动物和受试细胞
    1.2 主要试剂和材料
    1.3 主要仪器与耗材
第二章 实验方法
    2.1 动物模型的建立
    2.2 免疫组织化学技术
    2.3 细胞培养技术
        2.3.1 细胞的培养传代
        2.3.2 细胞的冻存
        2.3.3 细胞的复苏
    2.4 CCK-8 检测技术
        2.4.1 复制AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖模型
        2.4.2 测定熊果酸对AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖的影响
        2.4.3 转染si-SFRP4对模型组和给药组细胞活力的影响
        2.4.4 Wnt通路抑制剂XAV939和激活剂LiCl的毒性检测
    2.5 荧光定量PCR技术
        2.5.1 RNA的提取
        2.5.2 逆转录
        2.5.3 RTFQ-PCR
    2.6 Western Blot 技术检测蛋白表达
        2.6.1 细胞总蛋白的提取和浓度测定
        2.6.2 Western blotting具体步骤
        2.6.3 Western blot数据处理
    2.7 siRNA转染A7r5细胞
        2.7.1 转染效率的考察
        2.7.2 转染后的蛋白检测
    2.8 免疫荧光技术
    2.9 统计学方法
第三章 实验结果
    3.1 免疫组化结果
    3.2 CCK-8 检测细胞活力
        3.2.1 AngⅡ造模浓度的筛选
        3.2.2 UA有效保护浓度的筛选
        3.2.3 转染si-SFRP4对细胞增殖率的影响
        3.2.4 Wnt通路抑制剂、激活剂的细胞毒性检测
    3.3 UA对通路中各分子的影响
        3.3.1 UA对AngⅡ诱导的A7r5细胞内SFRP4的mRNA及蛋白表达的影响
        3.3.2 UA对AngⅡ诱导的A7r5细胞内β-catenin的mRNA及蛋白表达的影响
        3.3.3 UA对AngⅡ诱导的A7r5细胞内FoxO3a的mRNA及蛋白表达的影响183.3.4 UA对AngⅡ诱导的A7r5细胞内p27的mRNA及蛋白表达的影响
    3.4 SFRP4/wnt/β-catenin/Foxo3a/p27信号通路的验证
        3.4.1 Western Blot检测siRNA-SFRP4的基因沉默效率
        3.4.2 Western Blot检测si-SFRP4对模型组和UA组细胞中β-catenin蛋白表达水平的影响
        3.4.3 Wnt通路抑制剂XAV939对Foxo3a/p27的影响
        3.4.4 Wnt通路激动剂LiCl对Foxo3a/p27的影响
    3.5 免疫荧光结果
第四章 讨论
结论
参考文献
综述
    综述参考文献
攻读学位期间的研究成果
致谢



本文编号：3269468