喹诺酮类抗菌药物杀菌的两条不同途径及其作用机制研究

发布时间：2021-07-21 20:34

　　细菌耐药性是困扰感染性疾病临床治疗的难题之一;通过新策略降低细菌的药物耐受力、大幅提高药物杀菌活性,能有效遏制耐药性产生。喹诺酮是临床广泛使用的广谱抗菌药[1],自1962年第一代喹诺酮类药物萘啶酮酸发明以来,四代、成百上千种喹诺酮衍生物已经被成功合成,并且细菌ⅡA型拓扑异构酶（DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ）已经被确认为该类抗菌药物的作用靶点[2-4]。先前的研究表明:细菌DNA复制过程对菌体生长与存活至关重要,而这一过程需要DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的共同作用。在过去50多年中,喹诺酮类药物的广泛使用也说明这一药物作用靶点在临床治疗上的重要性;但是由于对喹诺酮类药物不恰当的使用乃至滥用,导致细菌耐药性的逐步上升,为确保这一行之有效的抗菌药物继续发挥其良好的治疗效果,确定其杀菌途径及作用机理迫在眉睫。我们新近证明喹诺酮可通过2条不同途径进行杀菌,各途径分别由不同的未知关键蛋白控制;并已筛选获得喹诺酮压力下既不生长也不死亡的药物耐受突变体。本课题以喹诺酮杀菌的2条途径为研究对象,利用已建立的药物耐受突变体富集/筛选技术、结合基因组测序,破译“蛋白从头合成依赖型”杀菌途径的关键效应调节“致死... 

【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２基因自发回复突变分析??

中进行诱导表达，通过调整诱导剂ＩＰＴＧ浓度、诱导温度和诱导时间三个参数，分??别摸索两种蛋白最适宜的表达条件。在诱导表达完成后进行超声破碎，离心后上清??使用变性剂变性，之后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，实验结果如图４：??／／７／０＇?／／／?Ｚ？／＾／／／／??ＪＩＨｌｉｌ?ＷＨＩＰ??Ｓｉｌｎ！?Ｉ！?＝?ＩＳＳｆｔ??图４野生型及突变型ＰｕｒＢ蛋白表达条件摸索??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ?ａｎｄ?ｍｕｔａｎｔ?ＰｕｒＢ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ??由上述结果图可以发现，野生型ＰｕｒＢ蛋白最适宜的诱导条件是０．５ｍＭ??ＩＰＴＧ，在２８°Ｃ下诱导８ｈ；而突变型ＰｕｒＢ蛋白最适宜的诱导表达条件是Ｏ．ｌｍＭ??ＩＰＴＧ，在２８°Ｃ下诱导８ｈ。在确定该条件后进行大量诱导表达，得到未纯化的两种??蛋白样品，之后使用Ｎｉ－ＮＴＡ琼脂糖凝胶（Ｈｉｓ标签纯化树脂）进行纯化，得到大量纯??化后的野生型和突变型ＰｕｒＢ蛋白样品，再对这两种蛋白进行结构分析，使用Ｐｙｍｏｌ??对三维结构进行模拟

图７ｐｗｒｖ４基因缺失表现出喹诺酮耐受表型??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?Ｍｕｔａｎｔ?ｏｆｐｕｒＡ?ｓｈｏｗｓ?ａ?ｔｏｌｅｒａｎｔ?ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ?ｔｏ?ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ??从图中可以发现，相比于野生型菌株，／ｗｄ基因缺失菌株表现出很强的耐受作??用，其耐受水平与基因缺失菌株基本一致，这一结果说明喹诺酮“蛋白从头合??成依赖型”杀菌途径与第一种假设－嘌呤生物合成代谢通路相关，而基因在该??通路中会起到两次作用，分别催化合成了?ＩＭＰ（次黄嗓呤）和ＡＭＰ?（腺嘌呤），所以??接下来实验目的是进一步确定其在嘌呤生物合成代谢通路中的哪…个环节起到关键??作用，通过代谢通路中的各关键中间产物回补ｐｗＭ基因缺失菌株，验证其杀菌表型??变化，起关键作用的中间产物在回补基因缺失菌株后，应该可使其耐受表型消??失，各关键中间产物回补；基因缺失菌株杀菌表型如图８、图９：??

【参考文献】：
期刊论文
[1]喹诺酮类药物及细菌对其耐药性机制研究进展[J]. 夏蕊蕊,国宪虎,张玉臻,徐海.  中国抗生素杂志. 2010(04)
[2]喹诺酮类抗菌药研究的新进展[J]. 张致平.  国外医药(抗生素分册). 2001(06)



本文编号：3295729