萘酰亚胺—多胺缀合物靶向溶酶体抑制食管鳞癌的作用及机制

发布时间：2021-07-24 15:01

　　实验目的:作为常见的消化道恶性肿瘤,食管鳞癌在全世界范围有着高发病率兼死亡率。患者确诊时往往在中晚期,预后差,五年生存率低,且他们通常要承受化疗药物带来的毒副反应。本课题组近年来合成的化合物TZY2与TZY是抗肿瘤活性比较好的萘酰亚胺-多胺缀合物。本课题将人源性食管鳞癌细胞KYSE-30、KYSE-150、EC-9706作为主要研究对象,探究化合物TZY2与TZY抑制食管鳞癌的作用和机制。实验方法:采用MTT法和CCK-8法检测化合物TZY2与TZY作用下食管鳞癌细胞的生存率;采用食管鳞癌细胞的平板克隆实验,观察TZY2作用下细胞的集落形成;使用倒置荧光显微镜检测化合物TZY2与TZY在食管鳞癌细胞中是否具有荧光并观察TZY2与TZY的荧光强度;在激光共聚焦显微镜下采集化合物TZY2与TZY在食管鳞癌细胞中的荧光成像;使用高内涵成像系统,检测TZY2与TZY在食管鳞癌细胞中的荧光值;采用Lyso-Tracker Red、Golgi-Tracker Red、ER-Tracker Red等染料标记在化合物作用下的食管鳞癌细胞,并在共聚焦显微镜下分析化合物与细胞器的共定位,以及检测化合物TZ... 

【文章来源】：河南大学河南省

【文章页数】：85 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 食管鳞癌的研究
    1.2 萘酰亚胺衍生物的研究
    1.3 多胺的研究
    1.4 溶酶体的功能
    1.5 本课题研究目的和意义
第2章 实验材料
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验细胞株
        2.1.2 实验器材
    2.2 主要实验试剂的配制
        2.2.1 配制主要细胞培养试剂
        2.2.2 配制染料工作液
        2.2.3 配制Western blot实验试剂
        2.2.4 配制化合物TZY2与TZY溶液
    2.3 实验试剂
        2.3.1 细胞培养类
        2.3.2 染料试剂类
        2.3.3 Western blot实验类
    2.4 实验仪器
第3章 实验方法
    3.1 食管鳞癌细胞的培养
        3.1.1 细胞复苏
        3.1.2 细胞传代
        3.1.3 细胞冻存
    3.2 MTT法测食管鳞癌细胞的增殖
        3.2.1 MTT法检测TZY2和TZY对食管鳞癌细胞增殖的影响
        3.2.2 Baf-A1与TZY2 联用对食管鳞癌细胞生存率的影响
    3.3 CCK-8 实验验证TZY2和TZY的作用
    3.4 细胞的克隆形成实验
    3.5 倒置荧光显微镜成像
        3.5.1 TZY2和TZY荧光性质的研究
        3.5.2 台盼蓝(trypan blue)染色法
        3.5.3 Caspase-3 活性检测试剂盒检测TZY2 作用下食管鳞癌细胞的凋亡
    3.6 FACSort流式细胞仪
        3.6.1 AnnexinⅤ/PI双染检测TZY2 作用下食管鳞癌细胞的凋亡
        3.6.2 TZY2作用食管鳞癌细胞PI染色的荧光强度
        3.6.3 Rh123染色检测TZY2对食管鳞癌细胞线粒体跨膜电位的影响
        3.6.4 MDC染色检测TZY2 对食管鳞癌细胞自噬的作用
    3.7 高内涵活细胞成像系统
        3.7.1 食管鳞癌细胞中TZY2与TZY的荧光强度
        3.7.2 DND-189 溶酶体探针染色检测TZY2 对食管鳞癌细胞溶酶体荧光强度和p H的改变
    3.8 共聚焦显微镜与超高分辨率显微成像
        3.8.1 共聚焦显微镜拍摄TZY2与TZY的荧光成像
        3.8.2 TZY2与TZY与食管鳞癌细胞器共定位分析
        3.8.3 TZY2与TZY作用下细胞中溶酶体的成像
    3.9 细胞划痕实验
    3.10 Western blot
        3.10.1 收集食管鳞癌细胞
        3.10.2 提取总蛋白
        3.10.3 Western blot详细操作
    3.11 统计学方法
第4章 实验结果
    4.1 TZY2和TZY对食管鳞癌细胞增殖的影响
        4.1.1 MTT法检测TZY2、TZY对 KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 细胞存活率的影响
        4.1.2 CCK-8 法验证TZY2、TZY能抑制三种食管鳞癌细胞的增殖
        4.1.3 TZY2有效抑制食管鳞癌细胞的集落形成
    4.2 TZY2和TZY在食管鳞癌细胞中的荧光成像
        4.2.1 TZY2在KYSE-30、KYSE-150 细胞中的荧光情况
        4.2.2 TZY在 KYSE-30、KYSE-150 细胞中的荧光情况
    4.3 TZY2和TZY在食管鳞癌细胞中的荧光强度检测
        4.3.1 荧光显微镜拍摄在KYSE-150和EC-9706 细胞中,TZY2 荧光强度大于TZY荧光强度
        4.3.2 共聚焦显微镜显示KYSE-30、KYSE-150 细胞中TZY2 荧光强度大于TZY
        4.3.3 高内涵细胞成像系统检测KYSE-30、KYSE-150 细胞中荧光强度
    4.4 TZY2和TZY在食管鳞癌细胞中的靶向性测定
        4.4.1 TZY2在食管鳞癌细胞中定位于溶酶体
        4.4.2 TZY在 KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 细胞中靶向溶酶体
    4.5 TZY2和TZY对食管鳞癌细胞中溶酶体的影响
        4.5.1 在KYSE-30 细胞中分别加入TZY2和TZY后溶酶体的变化
        4.5.2 在KYSE-150 细胞中分别加入TZY2和TZY后溶酶体的变化
        4.5.3 TZY2对KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 中溶酶体荧光强度和p H的改变
    4.6 TZY2对食管鳞癌细胞凋亡的影响
        4.6.1 Trypan blue染色检测TZY2 作用下KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 的细胞活力
        4.6.2 AnnexinⅤ/PI双染和PI染色检测在TZY2 作用下KYSE-30、KYSE-150、EC-9706细胞的凋亡
        4.6.3 Caspase-3 活性检测试剂盒测试TZY2 作用下食管鳞癌活细胞的凋亡情况
    4.7 TZY2对食管鳞癌细胞线粒体跨膜电位的影响
    4.8 TZY2对食管鳞癌细胞自噬的影响
        4.8.1 采用MDC染色检测KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 细胞在TZY2 作用下自噬体数量的改变
        4.8.2 Baf-A1 减弱TZY2对KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 细胞的抑制作用
    4.9 TZY2对食管鳞癌细胞迁移的影响
    4.10 Western Blot检测TZY2 对食管鳞癌细胞中蛋白表达的影响
        4.10.1 TZY2对凋亡相关蛋白表达的影响
        4.10.2 TZY2对自噬相关蛋白表达的影响
        4.10.3 TZY2对溶酶体相关蛋白表达的影响
第5章 实验讨论
第6章 实验结论
参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]多胺在癌症治疗中的作用及机制[J]. 马容,陈咨余,姜冬梅,康波.  生物技术通报. 2016(02)



本文编号：3300881