三角梅核糖体失活蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤功能研究
发布时间：2021-08-11 12:01
核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating proteins,RIPs）是广泛存在于高等植物的一类RNA N-糖苷酶,它能够催化断裂真核生物28S rRNA的特殊颈环结构的N-C糖苷键,脱去一个腺嘌呤,从而破坏核糖体的结构,阻遏蛋白质的生物合成。近年来,利用核糖体失活蛋白构造与抗癌药物结合构造的免疫毒素在治疗癌症方面显示出广阔的应用前景。三角梅核糖体失活蛋白Bouganin最初从红花三角梅（Bougainvillea spectabilis wild）中分离,为Ⅰ型核糖体失活蛋白,是目前所发现的毒性最低的一种RIPs。本实验室利用同源序列克隆法从厦门市紫叶三角梅中成功克隆Bouganin基因并进行了原核表达等研究工作。但由于原核表达的蛋白多以包涵体的形式存在,纯化困难,另外原核表达蛋白免疫制备的抗体效价不高。本研究克隆了三角梅核糖体失活蛋白基因Bouganin,然后以毕赤酵母（Pichia pastoris GS115）为表达菌株中,以pPIC9K为载体,构建了GS115-pPIC9K-Bouganin酵母的体外表达系统,然后对表达条件进行优化,最后利用固相金属离子亲和...
【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１核糖体失活蛋白的类型［１（）］??Ｆｉｌ．ｌ?Ｔｅｓ?ｏｆ?Ｒｉｏｏｍｅ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎＰｒｏｔｅｉｎ??
第一章绪论??得指出的是所有的ＲＩＰｓ都能够失活真核细胞的核糖体，但是少数ＲＩＰｓ，??、痢疾杆菌外毒素、紫茉莉属的抗病毒还能够失活原核细胞的核糖体［１２］露的ｒＲＮＡ对ＲＩＰｓ的敏感性不如完整的核糖体，表明核糖体上的蛋白对??ＮＡ相互作用具有十分重要的作用［１３］。研究发现将蓖麻毒素ｒｉｃｉｎ?Ａ链作??乳动物核糖体时，ｒｉｃｉｎＡ链会与核糖体上的Ｌ９，?ＬｌＯｅ蛋白相互作用［１４］；陆抗病毒蛋白ＰＡＰ作用于酵母核糖体时，会与其Ｌ３蛋白交联＾。苦瓜??白ＭＰＡ３０作用于２８Ｓ?ｒＲＮＡ时，需要依赖于Ｋ＋和ＮＨ４＋才能发挥活性［１６］。??Ｐｓ的Ｎ－糖苷酶活性作用底物除了哺乳动物的２８Ｓ?ｒＲＮＡ还包括酿酒酵母??的?２６Ｓ?ｒＲＮＡ，水稻（〇７知?的?２５Ｓ?ｒＲＮＡ，??肠杆菌中的２３ＳｒＲＮＡ等??
将带有质粒ＰＰＩＣ９Ｋ的保存菌株ＤＨ５ｃｘ扩增培养，使用Ｔａｋａｒａ质粒小??提试剂盒，提取质粒ＰＰＩＣ９Ｋ。用Ｎａｎｏ?ｄｒｏｐ?ＤＮＡ浓度测定仪测定ＤＮＡ浓度如??下图３－２：??ｆＳａｍｐｌｅ?ＩＤ?｜Ｕｓｅｒ?ｎａｍｅ?｜Ｄａｔｅ?ａｎｄ?Ｔｉｍｅ?｜Ｎｕｃｌｅｉｃ?Ａｃｉｄ?Ｃｏｎｅ．?｜Ｕｎｉｔ???１?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?２８４６?１３３?４?ｎｇ／ｐｌ??２?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３０?３２?１１２?６?ｎｇ／ｐｌ??３?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３１?２９?１４６?８?ｎｇ／ｐｌ??４?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３２：３６?１３３?ｎｇ／ｐｌ??５?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３３４３?－８?９?ｎｇ／ｐｌ??６?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３５?０２?１３７?ｎｇ／ｐｌ??７?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３６?１６?１８９?９?ｎｇ／ｐｌ??图３－２提取的ｐＰＩＣ９Ｋ质粒浓度??Ｆｉｇｕｒｅ?３－２．?ＤＮＡ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｐＰＩＣ９Ｋ??３７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]天花粉蛋白抗肿瘤作用及机制的研究进展[J]. 周海祥,卜平,董小耘,高云飞,孟杰依,邓心燕. 医学综述. 2017(16)
[2]应用玉米核糖体失活蛋白基因改善马铃薯对立枯丝核菌抗性[J]. 郝文胜,赵永秀,张永丰,东保柱,张少英. 分子植物育种. 2017(06)
[3]猪苓Ⅱ型核糖体失活蛋白A链基因的克隆以及原核表达[J]. 刘蒙蒙,邢咏梅,郭顺星. 药学学报. 2017(02)
[4]苦荞凝集素对结肠癌细胞增殖的抑制作用[J]. 贾乔瑾,崔晓东,王转花. 中国生物化学与分子生物学报. 2015(04)
[5]苦瓜MAP30蛋白的原核表达及其生物活性研究[J]. 邱华丽,穰杰,丁学知,胡胜标,张友明,朱道奇,夏立秋. 中国生物工程杂志. 2014(06)
[6]苦瓜MAP30基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达[J]. 王芳,王丽媛,乔禹,韩旭,丁国华. 北方园艺. 2013(24)
[7]核糖体失活蛋白及其在生物医学领域的应用与研究进展[J]. 赵婷,姚大卫,吴志斌,左雨鹏,邝咏衡,谢天顺,冯先玲,沙鸥,张健. 重庆医学. 2012(34)
[8]美洲商陆抗病毒蛋白在毕赤酵母中的表达及其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡的研究[J]. 向莉,胡亚梅,张杰文. 中国中西医结合杂志. 2011(08)
[9]三角梅核糖体失活蛋白在转基因番茄中的功能[J]. 张赛群,刘建军,刘铭,周涵韬. 厦门大学学报(自然科学版). 2011(04)
[10]家蚕微孢子虫蓖麻毒蛋白B链基因RBL463-4的克隆及在毕赤酵母中的表达[J]. 李能章,潘国庆,李田,贾立丽,邓远洪,周泽扬. 蚕业科学. 2010(06)
博士论文
[1]毕赤酵母表达系统及其应用[D]. 郭雨刚.中国科学技术大学 2012
硕士论文
[1]三角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究[D]. 宋丽娜.厦门大学 2006
本文编号：3336120
【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１核糖体失活蛋白的类型［１（）］??Ｆｉｌ．ｌ?Ｔｅｓ?ｏｆ?Ｒｉｏｏｍｅ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎＰｒｏｔｅｉｎ??
第一章绪论??得指出的是所有的ＲＩＰｓ都能够失活真核细胞的核糖体，但是少数ＲＩＰｓ，??、痢疾杆菌外毒素、紫茉莉属的抗病毒还能够失活原核细胞的核糖体［１２］露的ｒＲＮＡ对ＲＩＰｓ的敏感性不如完整的核糖体，表明核糖体上的蛋白对??ＮＡ相互作用具有十分重要的作用［１３］。研究发现将蓖麻毒素ｒｉｃｉｎ?Ａ链作??乳动物核糖体时，ｒｉｃｉｎＡ链会与核糖体上的Ｌ９，?ＬｌＯｅ蛋白相互作用［１４］；陆抗病毒蛋白ＰＡＰ作用于酵母核糖体时，会与其Ｌ３蛋白交联＾。苦瓜??白ＭＰＡ３０作用于２８Ｓ?ｒＲＮＡ时，需要依赖于Ｋ＋和ＮＨ４＋才能发挥活性［１６］。??Ｐｓ的Ｎ－糖苷酶活性作用底物除了哺乳动物的２８Ｓ?ｒＲＮＡ还包括酿酒酵母??的?２６Ｓ?ｒＲＮＡ，水稻（〇７知?的?２５Ｓ?ｒＲＮＡ，??肠杆菌中的２３ＳｒＲＮＡ等??
将带有质粒ＰＰＩＣ９Ｋ的保存菌株ＤＨ５ｃｘ扩增培养，使用Ｔａｋａｒａ质粒小??提试剂盒，提取质粒ＰＰＩＣ９Ｋ。用Ｎａｎｏ?ｄｒｏｐ?ＤＮＡ浓度测定仪测定ＤＮＡ浓度如??下图３－２：??ｆＳａｍｐｌｅ?ＩＤ?｜Ｕｓｅｒ?ｎａｍｅ?｜Ｄａｔｅ?ａｎｄ?Ｔｉｍｅ?｜Ｎｕｃｌｅｉｃ?Ａｃｉｄ?Ｃｏｎｅ．?｜Ｕｎｉｔ???１?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?２８４６?１３３?４?ｎｇ／ｐｌ??２?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３０?３２?１１２?６?ｎｇ／ｐｌ??３?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３１?２９?１４６?８?ｎｇ／ｐｌ??４?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３２：３６?１３３?ｎｇ／ｐｌ??５?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３３４３?－８?９?ｎｇ／ｐｌ??６?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３５?０２?１３７?ｎｇ／ｐｌ??７?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３６?１６?１８９?９?ｎｇ／ｐｌ??图３－２提取的ｐＰＩＣ９Ｋ质粒浓度??Ｆｉｇｕｒｅ?３－２．?ＤＮＡ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｐＰＩＣ９Ｋ??３７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]天花粉蛋白抗肿瘤作用及机制的研究进展[J]. 周海祥,卜平,董小耘,高云飞,孟杰依,邓心燕. 医学综述. 2017(16)
[2]应用玉米核糖体失活蛋白基因改善马铃薯对立枯丝核菌抗性[J]. 郝文胜,赵永秀,张永丰,东保柱,张少英. 分子植物育种. 2017(06)
[3]猪苓Ⅱ型核糖体失活蛋白A链基因的克隆以及原核表达[J]. 刘蒙蒙,邢咏梅,郭顺星. 药学学报. 2017(02)
[4]苦荞凝集素对结肠癌细胞增殖的抑制作用[J]. 贾乔瑾,崔晓东,王转花. 中国生物化学与分子生物学报. 2015(04)
[5]苦瓜MAP30蛋白的原核表达及其生物活性研究[J]. 邱华丽,穰杰,丁学知,胡胜标,张友明,朱道奇,夏立秋. 中国生物工程杂志. 2014(06)
[6]苦瓜MAP30基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达[J]. 王芳,王丽媛,乔禹,韩旭,丁国华. 北方园艺. 2013(24)
[7]核糖体失活蛋白及其在生物医学领域的应用与研究进展[J]. 赵婷,姚大卫,吴志斌,左雨鹏,邝咏衡,谢天顺,冯先玲,沙鸥,张健. 重庆医学. 2012(34)
[8]美洲商陆抗病毒蛋白在毕赤酵母中的表达及其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡的研究[J]. 向莉,胡亚梅,张杰文. 中国中西医结合杂志. 2011(08)
[9]三角梅核糖体失活蛋白在转基因番茄中的功能[J]. 张赛群,刘建军,刘铭,周涵韬. 厦门大学学报(自然科学版). 2011(04)
[10]家蚕微孢子虫蓖麻毒蛋白B链基因RBL463-4的克隆及在毕赤酵母中的表达[J]. 李能章,潘国庆,李田,贾立丽,邓远洪,周泽扬. 蚕业科学. 2010(06)
博士论文
[1]毕赤酵母表达系统及其应用[D]. 郭雨刚.中国科学技术大学 2012
硕士论文
[1]三角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究[D]. 宋丽娜.厦门大学 2006
本文编号：3336120
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