递送CRISPR的壳聚糖纳米复合物的构建与研究
发布时间：2021-09-16 18:34
高速蓬勃发展的前沿基因疗法迫切需求高效低毒的递送平台,因此可用于传输基因编辑工具的递送载体成为当前研究的热点。本文以开发用于CRISPR/Cas9基因编辑技术的非病毒载体为研究课题,构建了 CRISPR All-In-One表达质粒作为样板基因编辑系统模型,制备了改性壳聚糖类材料,探讨了以壳聚糖类材料作为非病毒类载体递送CRISPR/Cas9基因编辑工具的可行性。基因疗法是一种从遗传物质层面处理疑难重症的新兴治疗策略。在基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因治疗中,可通过构建共载sgRNA及Cas9蛋白的All-In-One表达质粒实现对目标基因的靶向处理。众多研究表明ApoE基因是一个极具发展潜力的基因治疗靶点,因此本研究通过基因重组技术构建了以其为靶标的CRISPR All-In-One表达质粒作为完整基因编辑系统模型。测序结果确认重组基因编辑质粒构建成功,紫外分光光度计检测结果证明提取质粒浓度高、纯度好。壳聚糖是一种天然带正电的线性多聚物,具有基因负载能力强、生物相容性高、细胞毒性低、易于修饰改性等诸多优点,作为非病毒类载体材料备受关注。但其水不溶性及低转染效率使其应用极大...
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－２?Ｂｂｓｌ酶切位点示意图??
常用试剂配置方法如表３－３所示：??表３－３常用试剂配置方法???ｉｔｍ?配置方法???ＮａＯＨ?Ｃ１５％，?ｗ／ｖ）?１０ｍＬｄｄＨ２Ｏ?中加?１．５?ｇＮａＯＨ??ＮａＣｌ?（１０％，?ｗ／ｖ）?１０?ｍＬ?ｄｄ?Ｈ２０?中加?１?ｇ?ＮａＣＩ??３．２实验方法??３．２．１改性壳聚糖类材料ＴＭＣ的合成??本研宄制备的Ｎ，Ｎ，Ｎ－三甲基化壳聚糖ＣＴＭＣ）采取一步法进行制备，生要??参照ｓｉｅｖｅｌ等人［５３］ＳＤｕｎｇ等人［５４］发表的合成方法，合成路线见图３－１，具体合成??步骤如下所示：??在１５０?ｍＬ圆底烧瓶中，加入１．０?ｇ已过筛壳聚糖粉末（＜５００?ｐｍ）、２．４?ｇ碘??化钾及４０?ｍＬ?１－甲基－２－吡咯烷酮，置于６０°Ｃ恒温油浴中避光搅拌至壳聚糖溶解??完全，溶液变成淡黄色，接着在搅拌下逐滴加入５．５?ｍＬ?ＮａＯＨ?（１５％，ｗ／ｖ）及６．０??ｍＬＣＨ３Ｉ，混合液继续于６０°Ｃ避光搅拌。期间进行薄层色谱法点板（配合碘缸显??色．）检测反应进度，反应宗全终止反应》??用１００ｍＬ乙醇沉淀得到产物ＴＭＩ?（Ｎ，Ｎ，Ｎ－三甲基化売聚糖碘化物），１０００??印１１１离心３?１］１丨１１后分离下鳥沉淀加入２〇１］１１＾他（＾１（１０％，评／￥＞，常温搅拌２１１进??行离子交换。??所得溶液用１００?ｍＬ乙醇再次沉淀，离心混合物去除含过量ＮａＣｌ的上清液，??所得过滤产物再分别用乙醇、乙醚彻底洗涤，４０°Ｃ下真空千燥，将所得产物溶于５０??ｍＬｄｄＨ２０中透析３ｄ，真空冷冻千燥，最终所得海绵状乳白色固体即为Ｎ，Ｎ，??Ｎ－Ｈ甲基化壳聚糖。??Ｈ〇?Ｈ〇?－＾Ａｃｈ，?ＨＯ??
ｉｓｈｅｒ?Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公旬），??以溴化钾压片法制样。将壳聚糖（ＣＳ）、所制得的Ｓ甲基化壳聚糖（ＴＭＣ）以及??溴化钾ＫＢｒ分别在研钵中充分研磨为极细粉末（粒度２００目），放入红外干燥箱??烘炙１２?ｍｉｎ，取ＣＳ及ＴＭＣ各１？２?ｍｇ加入ＫＢｒ均匀混合压片（ＫＢｒ与壳聚糖类??样品的比例约１００：１），以测定波数４０００？４００?ｃｍ４区间进行扫描分析。??３．３结果与讨论??３．３．１?ＴＭＣ?的１ＨＮＭＲ?结果??将ＴＭＣ溶解在Ｄ２０中，进行ｉＨ－ＮＭＲ分析，结果见图３－２。??Ｉ??ｇ?Ｓ?ｏｐ?？?〇５?ｗ??＾?ｃｏｃｏｃｏｔｏｃｏｃｏｃｏｃｏｃｏ?ｃｏｃｏ?ｃｉｏｉｏｉｃｓｃｖｉｏｉｏｉｏｊｃｊｏｉ??Ｉ?Ｉ?ＩＩ?Ｓｌ＾?Ｓｌ＾??Ｄ２〇?－ＣＯＣＨｓ????ｃｈ２ｏｈ?ｎ（ｃｈ３）２?ｃｈ２ｏｈ??Ｎ（ＣＨ３）３?ｃｈ２ｏｈ?ｎｈ??ｃ＝ｏ??－Ｎ（ＣＨ３）２??ＣＨ｜＿??－ｎ（ｃｈ３）３?８?＝ｑ??Ｓｉｇｎａｌ?ｐｐｍ??ｉ?Ｈ?ｏｆ?Ｎ－ａｃｅｔｙｌ?ｇｒｏｕｐ?２．１５??Ｈ?ｏｆ?Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ?ｇｒｏｕｐ?３．０１??｜?Ｈ?ｏｆ?Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ?ｇｒｏｕｐ?３．２９??Ｈ?ｏｆ?Ｃ２．?Ｃｅ．?Ｃｓ．?Ｃ４．?Ｃ３?３．４－４．４??－ＯＣＨ３?ＨｏｆＣｌ??Ｉ?ｉ?Ｉ??１??＾５Ｘ）?４＾?３Ｂ?Ｊ〇?Ｚ５?２Ｘｉ?Ｓ?１０?０５??ｆ１?（ｐｐｍ）??图３－２三甲基化壳聚糖（ＴＭＣ）的１ＨＮＭＲ图??２２??
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于环糊精构建的基因载体进展[J]. 徐妮为,刘梦艳,洪诗斌,颜蔚,付继芳,邓维. 化学进展. 2014(Z1)
[2]季铵盐壳聚糖纳米荧光探针的制备及细胞渗入研究[J]. 刘璠娜,饶华新,张子勇. 功能材料. 2008(05)
本文编号：3397083
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－２?Ｂｂｓｌ酶切位点示意图??
常用试剂配置方法如表３－３所示：??表３－３常用试剂配置方法???ｉｔｍ?配置方法???ＮａＯＨ?Ｃ１５％，?ｗ／ｖ）?１０ｍＬｄｄＨ２Ｏ?中加?１．５?ｇＮａＯＨ??ＮａＣｌ?（１０％，?ｗ／ｖ）?１０?ｍＬ?ｄｄ?Ｈ２０?中加?１?ｇ?ＮａＣＩ??３．２实验方法??３．２．１改性壳聚糖类材料ＴＭＣ的合成??本研宄制备的Ｎ，Ｎ，Ｎ－三甲基化壳聚糖ＣＴＭＣ）采取一步法进行制备，生要??参照ｓｉｅｖｅｌ等人［５３］ＳＤｕｎｇ等人［５４］发表的合成方法，合成路线见图３－１，具体合成??步骤如下所示：??在１５０?ｍＬ圆底烧瓶中，加入１．０?ｇ已过筛壳聚糖粉末（＜５００?ｐｍ）、２．４?ｇ碘??化钾及４０?ｍＬ?１－甲基－２－吡咯烷酮，置于６０°Ｃ恒温油浴中避光搅拌至壳聚糖溶解??完全，溶液变成淡黄色，接着在搅拌下逐滴加入５．５?ｍＬ?ＮａＯＨ?（１５％，ｗ／ｖ）及６．０??ｍＬＣＨ３Ｉ，混合液继续于６０°Ｃ避光搅拌。期间进行薄层色谱法点板（配合碘缸显??色．）检测反应进度，反应宗全终止反应》??用１００ｍＬ乙醇沉淀得到产物ＴＭＩ?（Ｎ，Ｎ，Ｎ－三甲基化売聚糖碘化物），１０００??印１１１离心３?１］１丨１１后分离下鳥沉淀加入２〇１］１１＾他（＾１（１０％，评／￥＞，常温搅拌２１１进??行离子交换。??所得溶液用１００?ｍＬ乙醇再次沉淀，离心混合物去除含过量ＮａＣｌ的上清液，??所得过滤产物再分别用乙醇、乙醚彻底洗涤，４０°Ｃ下真空千燥，将所得产物溶于５０??ｍＬｄｄＨ２０中透析３ｄ，真空冷冻千燥，最终所得海绵状乳白色固体即为Ｎ，Ｎ，??Ｎ－Ｈ甲基化壳聚糖。??Ｈ〇?Ｈ〇?－＾Ａｃｈ，?ＨＯ??
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【参考文献】：
期刊论文
[1]基于环糊精构建的基因载体进展[J]. 徐妮为,刘梦艳,洪诗斌,颜蔚,付继芳,邓维. 化学进展. 2014(Z1)
[2]季铵盐壳聚糖纳米荧光探针的制备及细胞渗入研究[J]. 刘璠娜,饶华新,张子勇. 功能材料. 2008(05)
本文编号：3397083
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