纳米载体递送核酸药物用于干预免疫细胞功能的研究

发布时间：2021-11-26 21:53

　　恶性肿瘤是世界上威胁人类健康的主要疾病之一。越来越多的证据显示,恶性肿瘤具有复杂的微环境,其中包括肿瘤细胞和各种类型的免疫细胞等。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是多数癌症类型中肿瘤浸润性免疫细胞的重要部分。TAM由Ly6Chi的循环单核细胞分化产生,并在肿瘤进展、血管生成、转移、免疫抑制和治疗抗性中扮演着重要的角色。干预单核细胞向肿瘤组织募集的关键信号传导途径如CCL2-CCR2是对肿瘤微环境调控和癌症治疗最有希望的途径之一。针对单核细胞免疫功能干预和治疗的一个关键问题是如何有效的将治疗剂递送到单核细胞中。研究表明,纳米载体的表面特性会显著影响其与免疫细胞的相互作用。通过调控纳米载体的特性可以改善其干预免疫细胞功能的能力并提高治疗效果。在本项目中,我们系统地研究了纳米载体的表面电位与其在体内单核细胞中的生物分布之间的关系,筛选并鉴定出适合单核细胞靶向的递送系统。结果显示,与中性纳米颗粒相比,阳离子脂质辅助的纳米颗粒更倾向于被单核细胞摄取。进一步我们证明,包裹CCR2小干扰RNA（siRNA）的阳离子纳米颗粒（CNP/siCCR2）可以更有效地改变免疫抑制的肿瘤微环境,并在原位小鼠乳腺癌模型... 

【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：99 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 免疫细胞与疾病发展
        1.1.1 单核巨噬细胞与肿瘤发展
        1.1.2 树突状细胞与移植排斥
    1.2 癌症与移植排斥治疗现状
    1.3 核酸类药物的应用及面临的挑战
        1.3.1 小干扰RNA类核酸药物应用前景及面临挑战
        1.3.2 基因编辑类核酸药物应用前景及面临挑战
    1.4 核酸类药物递送纳米载体在免疫相关疾病治疗中的应用
    1.5 选题依据及主要研究内容
    参考文献
第二章 阳离子脂质辅助的纳米颗粒递送CCR2的siRNA干预炎性单核细胞用于肿瘤微环境改造和治疗
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 主要材料
        2.2.2 主要试剂和设备
        2.2.3 细胞与实验小鼠
    2.3 实验方法
        2.3.1 递送siRNA纳米载体库的制备
        2.3.2 递送siRNA纳米载体库的表征
        2.3.3 流式细胞术(FACS)检测包载siRNA纳米载体在体内单核细胞中的生物分布
        2.3.4 FACS检测单核细胞在荷瘤小鼠外周血、脾脏和骨髓中的比例
        2.3.5 FACS检测CCR2在不同免疫细胞中的表达
        2.3.6 FACS检测包载CCR2 siRNA的纳米颗粒在体内对CCR2的沉默效果
        2.3.7 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测包载CCR2 siRNA的纳米颗粒在体内对CD11b~+Ly6C~(hi)单核细胞CCR2的沉默效果
        2.3.8 Western blot检测包载CCR2 siRNA的纳米颗粒在体内对CD11b~+Ly6C~(hi)单核细胞CCR2的沉默效果
        2.3.9 FACS检测治疗后肿瘤内免疫细胞的浸润情况
        2.3.10 qRT-PCR检测瘤内与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)有关的基因表达
        2.3.11 小鼠原位乳腺癌模型的建立与治疗
        2.3.12 小鼠乳腺癌肺转移的鉴定
        2.3.13 qRT-PCR检测阿霉素(DOX)治疗后瘤内CCL2的表达
        2.3.14 免疫组化检测治疗结束后肿瘤细胞的增殖与凋亡
    2.4 结果和讨论
        2.4.1 表面不同电性纳米载体库的构建
        2.4.2 不同电性纳米颗粒在体内单核细胞中的生物分布
        2.4.3 CCR2在体内不同免疫细胞中的表达及包载CCR2 siRNA纳米颗粒对CCR2的沉默效果
        2.4.4 包载CCR2 siRNA的阳离子纳米颗粒(CNP/siCCR2)对肿瘤微环境的改造
        2.4.5 CNP/siCCR2抑制乳腺癌的原位生长及肺部转移
        2.4.6 CNP/siCCR2下调CCR2的表达提高化学疗法的效果
    2.5 本章小结
    参考文献
第三章 阳离子脂质辅助的纳米颗粒递送CRISPR/Cas9干预树突状细胞用于抗移植免疫排斥的研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 主要材料
        3.2.2 主要试剂和设备
        3.2.3 细胞与实验小鼠
    3.3 实验方法
        3.3.1 递送mRNA纳米颗粒的制备与表征
        3.3.2 FACS检测骨髓来源的树突状细胞(BMDC)对包载Cy5-RNA纳米颗粒( CLAN_(Cy5-RNA))的体外摄取
        3.3.3 共聚焦显微镜(CLSM)观察BMDC对CLAN_(Cy5-RNA)的体外摄取
        3.3.4 FACS检测CLAN_(mRNA)对BMDC的体外转染效率
        3.3.5 Western blot检测CLAN_(mRNA)对BMDC的体外转染效率
        3.3.6 T7E1检测CLAN_(mCas9/gD40)对BMDC的体外基因编辑效果
        3.3.7 Western blot检测CLAN_(mCas9/gCD40)对BMDC的体外基因编辑效果
        3.3.8 FACS检测体内DC对CLAN_(Cy5-RNA)的摄取
        3.3.9 FACS检测体内CLAN_(mRNA)递送mRNA到DC并表达目的蛋白的效率
        3.3.10 Western blot检测体内CLAN_(mRNA)递送mRNA到DC并表达目的蛋白的效率
        3.3.11 T7E1检测体内CLAN_(mCas9/gCD40)对DC的基因编辑效果
        3.3.12 Western blot检测体内CLAN_(mCas9/gCD40)对DC的基因编辑效果
        3.3.13 小鼠急性排斥模型的建立与治疗
        3.3.14 FACS检测治疗后共刺激分子的表达、T细胞的激活和调节性T细胞的变化
        3.3.15 免疫组化检测治疗后移植物的损伤和调节性T细胞的浸润
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 CLAN_(mCas9/gRNA)的制备与表征
        3.4.2 CLAN_(mCas9/gRNA)递送mRNA到胞内
        3.4.3 CLAN_(mCas9/gCD40)体外敲除DC的CD40
        3.4.4 CLAN_(mCas9/gCD40)体内敲除DC的CD40
        3.4.5 CLAN_(mCas9/gCD40)缓解急性移植物排斥
        3.4.6 CLAN_(mCas9/gCD40)抑制共刺激分子的表达和T细胞的激活
    3.5 本章小结
    参考文献
附录一 主要试剂
附录二 主要仪器设备
附录三 主要溶液配制
附录四 常规实验方法
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果



本文编号：3520983