CELL-SELEX基础上PANC-1核酸适配体的筛选

发布时间：2021-11-27 22:12

　　胰腺癌是一种高度恶性的消化系肿瘤,其临床表现隐匿,发展迅速,预后极差,成为肿瘤病学的一大挑战。目前胰腺癌的临床发现和诊断基本上是依赖组织成像学及细胞检测方法,难以实现早期诊断。在此背景下,细胞适配体因其高亲和力和高选择性等众多优势而备受关注,CELL-SELEX技术也因其独特的优势得到了快速的发展,为解决上述问题提供了一种新思路。本工作基于CELL-SELEX技术,以人胰腺癌细胞株PANC-1为靶细胞,以人肺腺癌细胞A549为对照细胞,开展能特异性识别PANC-1的核酸适配体的筛选工作。主要研究内容包括:1.对筛选中涉及的PCR问题进行详细的探讨。本研究主要通过循环数的调整来获得高效且特异性的PCR结果。在筛选前部分都投入大量的模板进行PCR以减少有效序列的遗失,并讨论了不同的PCR情况对筛选的影响。2.对进化文库的制备与定量问题进行详细的研究。在进化文库的制备中,针对双链变为单链的过程进行了荧光监控。在进化文库的脱盐处理上,比较了乙醇沉淀法与除盐干燥法的优缺点。在进化文库的定量问题上,针对羧基荧光素FAM荧光强度对p H的敏感性,分别采用了0.2M Na OH和1×BB为背景进行定量... 

【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：94 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

核酸适配体与靶分子结合原理示意图

序 言 CELL-SELEX 基础上 PANC-1 核酸适配体的筛选(1) 筛选所需的寡核苷酸文库是通过化学方法合成，无需通过动物体内，可大量快速在体外合成。(2) 靶标范围很广泛，小到 ATP、病毒、金属离子[23-25]、氨基酸[26-29]等小分子，大到酶、肽以及不同大小和功能的蛋白质[30-31,81-83]等生物大分子，也可以是完整的细胞[32-37]、切片[59]等。(3) 相对于抗体有更高的亲和性和稳定性，蛋白容易失活，在构建生物传感器时其物理化学性质不稳定，和变性的适配体很容易复性。(4) 结构简单，容易进行结构的设计和修饰，如在其末端连接一些活性基团。(5) 还有分子量小、体积小、无免疫原性[90,91]、组织渗透好等优点正是由于核酸适配体优异的性质，引起了研究者的广泛关注，核酸适配相关的研究也如火如荼。如图 2 所示，自 1990 年发现以来，研究者们通过修改 SELEX 方法，扩大筛选靶标范围，SELEX 技术经历了里程碑式的发展。

文库的构建：利用 DNA 化学合成技术，构建一个核酸适配体文库1013~1018条不同碱基的序列，序列组成包括一个中间序列可变的随定的恒定区。随机序列区一般包15~60个碱基之间，两端特定序列区间，后者在 PCR 中作为引物的结合位点。若使用 RNA 作为文库，区加入噬菌体 T7 启动子，以使 RNA 文库转化成 DNA 文库。文库与靶分子的结合：将随机寡核苷酸文库与靶细胞在合适的缓冲使靶细胞与结合能力强的序列形成“核酸-靶细胞”复合物。增加负筛选，即将筛选文库和对照细胞孵育结合，收集未与对照细再将该上清液投入靶细胞中进行孵育。反筛选的引入有利于将非特快速淘汰。分离：通过一些合适的分离方法，如传统的亲和层析、硝酸纤维膜，将与靶细胞结合能力强的寡核苷酸保留，而未结合的和结合弱寡离。

【参考文献】：
期刊论文
[1]血清CA199 CA125 CA242癌胚抗原表达水平与胰腺癌的早期诊断和预后转归的关联性研究[J]. 马学柱.  山西医药杂志. 2016(13)
[2]厄洛替尼联合吉西他滨治疗胰腺癌有效性和安全性的Meta分析[J]. 谢铮铮,梁瑶,孙路路.  中国临床药理学杂志. 2016(08)
[3]胰腺癌MRI研究进展[J]. 徐生芳,郭顺林,辛仲宏,杨梅,张艳利.  中国CT和MRI杂志. 2014(02)
[4]微小RNA与胰腺癌关系研究进展[J]. 胡应霞,张海蓉.  医学研究生学报. 2014(04)
[5]SELEX法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立[J]. 李真真,韩跃武,刘玲玲,韩亚萍,路艳,王春霞.  生物技术. 2009(03)

硕士论文
[1]核酸适配体纳米粒柔性支架及其循环肿瘤细胞的高效捕获[D]. 刘玲.苏州大学 2016
[2]应用CELL-SELEX筛选PANC-1细胞适配体技术研究[D]. 鲍立新.苏州大学 2015



本文编号：3523143