Tat-PTD-Endostatin-RGD的规模化制备及冻干制剂的研究

发布时间：2022-01-08 03:41

　　内皮抑素（endostatin）是一个20kDa的蛋白质,能够抑制新生血管的生成。血管生成是从已有的毛细血管发展而形成新的血管,涉及各种生理和病理过程,如肿瘤的发展、糖尿病视网膜病变（DR）等。血管生成抑制剂的出现,为一些与血管生成相关的疾病的治疗提供了新的手段。本实验室在前期实验中将可以穿过血眼屏障的穿膜肽Tat-PTD与靶向肽RGD分别连接在内皮抑素的两端,设计并表达出了Tat-PTD-Endostatin-RGD,并验证其活性,证明Tat-PTD-Endostatin-RGD具有好的抗细胞增殖活性、抗细胞迁移能力以及穿过血眼屏障的能力,并可以与眼底血管细胞表面受体特异性结合,使内皮抑素可以通过滴眼给药达到眼底,抑制视网膜血管生成。但是,前期实验所制备的Tat-PTD-Endostatin-RGD是以包涵体的形式表达,产率不高;另外Tat-PTD-Endostatin-RGD不稳定,在放置过程中易于沉淀,不利于将来的开发应用。基于这些问题,本论文研究Tat-PTD-Endostatin-RGD 的规模化制备及冻干制剂,为 Tat-PTD-Endostatin-RGD的新药开发奠定基... 

【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２－１?Ｔａｔ－ＰＴＤ－Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ－ＲＧＤ可溶性表达的￡．ｃｏ／／菌种及诱导剂的选择??

３．２?Ｔａｔ－ＰＴＤ－Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ－ＲＧＤ可溶性表达蛋白的纯化??选用３种浓度的冲洗缓冲液对上样且平衡完成的ＮＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱子进行冲??洗，收集洗脱缓冲液进行电泳结果见图２－２，使用ＢａｎｄＳｃａｎ?５．０对结果进行处理，??在２６?ｋＤ，目的蛋白分子量处，发现使用４５?ｍｍｏｌ／Ｌ咪挫的Ｎｉ２＋－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ冲洗缓冲??液最后洗脱后目的蛋白含量最局。??进行二次纯化的结果见图２－３，发现ＵＶ２８〇有两个吸收峰，分别收集组分电泳??后使用ＢａｎｄＳｃａｎ５．０对结果进行处理，见图２－４。经过Ｎｉ２＋－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ进行初步纯化??后目的蛋白纯度约为５９％，使用Ｓｅｐｈｄｅｘ－Ｇ５０进行二次纯化后的目的蛋白纯度约??为９０．９％。ＢＣＡ试剂盒测定纯化蛋白含量，每升￡．ｃｏ／／Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）可纯化出约??１．３?ｍｇ可溶性目的蛋白。??Ｍｌ?２?Ｍ３??２６?ｋＤ?卓??２０ｋＤ?ｎｍｎｎｉｍｉ邊??图２－２使用不同浓度冲洗缓冲液后纯化蛋白??Ｍ．蛋白分子量标准；１．４５ｍｍｏｌ／Ｌ咪哩；２．４０ｍｍｏｌ／Ｌ咪哩；３．３５ｍｍｏｌ／Ｌ咪挫??Ｆｉｇ．?２

?１１０??１１＾??图２－３?Ｓｅｐｈｄｅｘ－Ｇ５０层析分离结果??Ｆｉｇ．?２－３?Ｅｌｕｔｉｏｎ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?Ｓｅｐｈｄｅｘ－Ｇ５０?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．（见实验??记录０００２１６５－ｐｌ８）??１?２?３?４?５?６?Ｍ??一?？?＿＿???６６?ｋＤ??ｔ通?—?４５?ｋＤ??—?—?３３?，Ｄ??二二．－一卜?２６ｋＤ??、鋒％?２０?ｋＤ??”?１４．４?ｋＤ????』??图２－４目的蛋白亲和层析纯化结果??Ｌ流穿液；２．Ｎｉ２＋－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ平衡缓冲液；３．Ｎｉ２＋－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ冲洗缓冲液；４．??Ｎｉ２＋－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ洗脱缓冲液；５，?Ｓｅｐｈｄｅｘ－Ｇ５０第一峰；６．?Ｓｅｐｈｄｅｘ－Ｇ５０第二峰；Ｍ??标


本文编号：3575826