ABIN-1对MOR功能的调节机制研究

发布时间：2017-05-12 22:01

  本文关键词：ABIN-1对MOR功能的调节机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：阿片类药物具有强效镇痛作用,但反复使用后,容易出现依赖和耐受而引起成瘾,因此大大限制了其在临床上的使用。多年来,国内外学者从阿片受体和非阿片受体系统等多个方面探索阿片成瘾机制,取得了很大进展,但有关阿片成瘾的分子生物学机制仍未阐明。近年来,随着分子生物学的发展,人们发现一些蛋白能通过与阿片受体的相互作用影响阿片受体功能。因此,寻找与阿片受体相互作用的蛋白,研究其对阿片受体功能的影响,对阐明阿片成瘾的机制具有重要意义。A20结合核因子抑制蛋白(A20 binging inhibitor of NF-κB activation, ABIN-1)为新发现的免疫和炎症性疾病相关的细胞内重要调节蛋白,目前尚未见其在中枢神经系统分布及功能研究的相关报道。我们在前期研究中发现,ABIN-1的mRNA及蛋白在大、小鼠脑前皮层、海马、纹状体、伏隔核等脑区有广泛分布,且在吗啡慢性作用后,ABIN-1在各脑区表达明显上调,因而推测该蛋白与阿片依赖关系密切。前期研究中在CHO上初步确定了ABIN-1与μ-阿片受体(μ-opioid receptor, MOR)存在相互作用,ABIN-1过表达后能抑制MOR激动活性,对激动剂作用于MOR后受体的内吞及脱敏也有抑制作用。基于此,本课题开展了如下研究。研究目的：1、在体验证ABIN-1与MOR的相互作用,进一步验证ABIN-1与其他GPCR有无相互作用。2、研究ABIN-1对MOR功能的调节机制。研究方法：1、在SH-SY5Y细胞及大鼠脑皮层中采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)实验验证ABIN-1与MOR是否存在相互作用。2、通过Co-IP实验分析ABIN-1与δ-阿片受体(δ-opioid receptor, DOR)、κ-阿片受体(K-opioid receptor, KOR)等阿片受体及非阿片受体有无相互作用,明确ABIN-1与MOR的相互作用是否具有特异性。3、在受体水平上,用免疫沉淀法观察ABIN-1对MOR磷酸化、泛素化及脱磷酸化的影响；通过实时定量PCR (RT-qPCR)初步筛选ABIN-1调节的信号分子；在mRNA水平及蛋白水平筛选有效干扰ABIN-1的siRNA,验证调控ABIN-1表达对MOR磷酸化的调节作用。4、在受体后水平,用免疫印迹法分析过表达ABIN-1对MOR激活后ERK磷酸化及CREB磷酸化的影响。实验结果：1、Co-IP实验表明在SH-SY5Y细胞及大鼠脑皮层ABIN-1与MOR存在相互作用,与过表达ABIN-1及MOR的CHO细胞上结果一致,进一步证明ABIN-1与MOR存在相互作用。2、连续7天给大鼠吗啡5-35 mg/kg (s.c.)处理后,取大鼠脑皮层通过Co-IP实验验证ABIN-1与MOR的相互作用,结果表明吗啡处理组ABIN-1与MOR的相互作用明显强于盐水组；10μM吗啡或1DAMGO处理SH-SY5Y细胞24 h后,ABIN-1与MOR相互作用也明显增强,表明激动剂慢性作用于MOR后能促进ABIN-1与MOR的相互作用,并进一步证实ABIN-1与MOR存在相互作用。3、将ABIN-1与KOR、DOR或阿片孤儿受体(opioid receptor-like 1 receptor, ORL1)共同瞬时转染于HEK293细胞后,采用Co-IP实验研究发现,ABIN-1与上述三种阿片受体亚型存在相互作用；且与其他G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCR)如MrgD受体等也存在相互作用,但是ABIN-1对这些受体功能的影响还有待进一步研究。4、采用稳定表达MOR (MOR-CHO)及共同稳定表达MOR和ABIN-1 (MOR-ABIN-1-CHO)的细胞系,对ABIN-1调节MOR功能的分子机制进行了研究。ABIN-1过表达抑制DAMGO作用后MOR的磷酸化和泛素化,明显延缓MOR脱磷酸化,且在mRNA水平上抑制GRK2及β-arrestin2的表达。5、MOR-CHO细胞和MOR-ABIN-1-CHO细胞分别用5μM DAMGO处理1-360 mmin。发现DAMGO处理20 min后过表达ABIN-1明显抑制ERK磷酸化；处理40 min后,过表达ABIN-1对CREB磷酸化有显著抑制作用；提示ABIN-1对MOR激活后的信号转导也有显著抑制作用。结论ABIN-1与MOR在过表达细胞系、SH-SY5Y细胞及大鼠脑组织存在相互作用,且激动剂慢性作用后能促进两者间相互作用；ABIN-1与其他阿片受体亚型也存在相互作用,提示ABIN-1不是MOR的特异性相互作用蛋白,对其他受体功能可能也具有调节作用。ABIN-1与MOR相互作用后能够抑制DAMGO作用后的MOR磷酸化和泛素化,且明显延缓MOR脱磷酸化。这些结果提示,ABIN-1与MOR相互作用后能负性调控MOR的功能,其对阿片成瘾的影响有待进一步研究。
【关键词】：ABIN-1 MOR 泛素化 磷酸化 ERK磷酸化 CREB磷酸化
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 个人简历3-6
• 摘要6-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-22
• 第一章 ABIN-1与MOR相互作用及其特异性的验证22-46
• 1 实验材料22-27
• 2 实验方法27-33
• 3 实验结果33-45
• 3.1 ABIN-1与MOR相互作用的验证33-35
• 3.2 在SH-SY5Y细胞中验证ABIN-1与MOR相互作用35-38
• 3.3 在大鼠脑组织中ABIN-1与MOR的相互作用38-40
• 3.4 ABIN-1与其他阿片受体及非阿片受体的相互作用40-45
• 4 小结45-46
• 第二章 ABIN-1对MOR功能的调节机制研究46-67
• 1 实验材料46-49
• 2 实验方法49-52
• 3 数据处理52
• 4 实验结果52-66
• 4.1 稳转细胞中MOR及蛋白ABIN-1的表达52-54
• 4.2 ABIN-1对MOR功能的调节机制54-63
• 4.3 ABIN-1对MOR激活后受体后信号分子的影响63-66
• 5 小结66-67
• 讨论67-73
• 结论73-74
• 参考文献74-84
• 附录184-87
• 综述87-105
• 参考文献100-105
• 致谢105-107
• 硕士期间(待)发表的文章107-108
• 附件108-115

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 方芳,汪青,曹清,刘景生;吗啡依赖小鼠脑组织cAMP系统的变化及腺苷酸环化酶磷酸化调节[J];中国医学科学院学报;2000年01期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 王萧;蛋白ABIN1与μ阿片受体的作用及其功能影响研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

2 赵钧如;ABIN1与μ阿片受体功能的相互调节[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年

  本文关键词：ABIN-1对MOR功能的调节机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：360920