一种用于药物蛋白亲和纯化和跨膜转运的双功能标签的开发

发布时间：2022-01-26 13:40

　　目的:开发一种既能用于亲和纯化目标蛋白,又可介导不能自主进入细胞的药物蛋白跨膜转运到细胞内发挥活性的双功能标签。方法:从已有文献资料中挑选四种富含碱性氨基酸的钙调蛋白结合肽（calmodulin binding peptide,CBP）,将其与绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达,然后采用与钙调蛋白（calmodulin,CaM）亲和结合过程来筛选与CaM具有最高亲和力的CBP;随后采用荧光显微镜检测、激光共聚焦显微镜检测以及流式细胞术等技术来分析测定和比较候选CBP序列将EGFP重组蛋白自主转运进入细胞的能力。最后将筛选到的新型CBP双功能标签与凋亡蛋白融合表达,考察其与CaM亲和结合后纯化重组凋亡蛋白的能力,以MTT法分析此重组蛋白进入肿瘤细胞抑制生长的能力。结果:通过CaM-CBP亲和层析筛选出与CaM具高有亲和力的三种CBP序列;从重组蛋白胞内荧光检测结果得知,带有野生型骨骼肌肌球蛋白轻链激酶CBP序列（MLCK）的重组EGFP蛋白具有最佳跨膜转运效率,且显著高于来源于艾滋病毒的经典穿膜肽TAT的穿膜效率。以此MLCK新型双功能标签成功地通过CaM-CBP亲和结合纯化得到重组凋亡蛋... 

【文章来源】：中国生物工程杂志. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章页数】：13 页

【部分图文】：

质粒示意图

理论上，已经通过His标签亲和吸附在Ni-NTA琼脂糖凝胶介质上的CaM可与带有CBP标签的重组蛋白再进行亲和结合，而通过这种“接力”亲和结合层析分离得到的目标蛋白(EGFP-CBP)越多，说明相应的亲和标签CBP与CaM亲和力越强。我们以SDS-PAGE分析了通过上述这种“接力”CaM-CBP亲和层析纯化得到的目的蛋白的数量。结果显示，在过量吸附的情况下，等量亲和凝胶介质吸附的EGFP-CaMKI、EGFP-MLCK、EGFP-smMLCK三种重组蛋白的量远多于EGFP-L-Selectin蛋白的量(图2b、c)，其中以EGFP-MLCK蛋白的含量最高，凝胶扫描表明的蛋白纯度极高。BCA试剂盒定量检测蛋白样品的浓度，EGFP-CaMKI、EGFP-MLCK、EGFP-smMLCK、EGFP-L-Selectin四种蛋白的浓度依次为:2.52mg/ml、3.63mg/ml、2.28mg/ml、0.44mg/ml，表明四种CBP与CaM亲和力由强到弱依次为MLCK、CaMKI、sm MLCK、L-Selectin。此外，研究在相同的实验条件下，通过商业化CaM亲和层析介质(GE公司产品)来验证四种CBP与CaM的亲和力大小。商业化的CaM介质是将CaM通过化学键直接修饰在琼脂糖介质上，带有CBP标签的重组蛋白可以与固定在琼脂糖介质上的CaM直接进行亲和结合，与CaM亲和力越高的CBP，纯化得到对应的蛋白越多。SDS-PAGE分析洗脱的蛋白样品，纯化得到蛋白量由高到低依次为:EGFP-MLCK、EGFP-CaMKI、EGFP-sm MLCK、EGFP-L-Selectin(图3)，与CaM-CBP亲和层析实验结果一致，MLCK、CaMKI、sm MLCK三种CBP与CaM具有较高的亲和力，这三种CBP可作为亲和标签分离目的蛋白。

此外，研究在相同的实验条件下，通过商业化CaM亲和层析介质(GE公司产品)来验证四种CBP与CaM的亲和力大小。商业化的CaM介质是将CaM通过化学键直接修饰在琼脂糖介质上，带有CBP标签的重组蛋白可以与固定在琼脂糖介质上的CaM直接进行亲和结合，与CaM亲和力越高的CBP，纯化得到对应的蛋白越多。SDS-PAGE分析洗脱的蛋白样品，纯化得到蛋白量由高到低依次为:EGFP-MLCK、EGFP-CaMKI、EGFP-sm MLCK、EGFP-L-Selectin(图3)，与CaM-CBP亲和层析实验结果一致，MLCK、CaMKI、sm MLCK三种CBP与CaM具有较高的亲和力，这三种CBP可作为亲和标签分离目的蛋白。2.2 CBP亲和标签的穿膜效率研究

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3610588