还原/pH双重响应与RGD修饰PAMAM靶向载药系统及其抗肿瘤作用机制研究

发布时间：2022-02-20 00:50

　　本研究旨在构建具长循环、主动靶向、还原和p H敏感释药等功能于一体的聚合物释药系统。首先以4代的聚酰胺-胺树状大分子（Polyamidoamine dendrimer,PAMAM）为聚合物骨架材料,通过二硫键将聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）连接在PAMAM的表面,合成不同PEG化程度的PAMAM-SS-PEG（PSSP）聚合物,然后以阿霉素（Doxorubicin,DOX）为抗肿瘤模型药物制备了PAMAM-SS-PEG/DOX（PSSP/DOX）复合物。通过考察不同聚合物对载药系统体内外活性的影响,优选出PEG化程度最佳的聚合物PSSP32作进一步研究。为了进一步提高PSSP32聚合物的主动靶向作用,增强其抗肿瘤活性,采用双功能化的HS-PEG5000-COOH偶联c RGDy K多肽和PAMAM,合成RGD-PEG-SS-PEG-PAMAM（RGD-PSSP）聚合物,并在此基础上制备了RGD-PEG-SS-PEG-PAMAM/DOX（RGD-PSSP/DOX）复合物。随后对复合物的制剂学特性、细胞毒性、细胞摄取、摄取机制以及荷瘤小鼠的体内抗肿瘤活性进行了研... 

【文章来源】：苏州大学江苏省211工程院校

【文章页数】：116 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
前言
    1.聚酰胺-胺树状大分子的研究进展
        1.1 PAMAM作为基因载体的研究
        1.2 PAMAM作为药物载体的研究
        1.3 PAMAM作为磁共振成像对比剂的研究
        1.4 PAMAM的生物相容性
    2. 还原敏感纳米载药系统的研究进展
    3. RGD多肽靶向介导作用的研究进展
    4. 纳米载药系统的细胞摄取
    5. 课题设计思路及研究内容
        5.1 本课题的设计思路
        5.2 本文主要研究内容
第一章 PAMAM-SS-PEG聚合物的合成及性质表征
    1 材料与仪器
        1.1 材料
        1.2 仪器
        1.3 细胞
    2 实验方法
        2.1 PAMAM-SS-PEG聚合物的合成
        2.2 PAMAM-SS-PEG聚合物的结构确证
            2.2.1 PAMAM-SS-PEG的核磁共振氢谱（1H NMR）分析
            2.2.2 PAMAM-SS-PEG的红外光谱（FTIR）分析
        2.3 粒径和Zeta电位测定
        2.4 还原敏感性考察
        2.5 溶血毒性考察
        2.6 血清中稳定性考察
        2.7 体外长循环作用考察
        2.8 RBITC-PSSP聚合物胞内转运考察
            2.8.1 RBITC-PSSP聚合物的合成及表征
            2.8.2 共聚焦显微镜观察RBITC-PSSP聚合物的细胞内转运
    3 结果与讨论
        3.1 PAMAM-SS-PEG聚合物的合成和后处理
        3.2 PAMAM-SS-PEG聚合物的结构确证
            3.2.1 PAMAM-SS-PEG的1H NMR分析
            3.2.2 PAMAM-SS-PEG聚合物的FTIR分析
        3.3 粒径和电位测定
        3.4 还原敏感性考察
        3.5 溶血毒性考察
        3.6 血清中稳定性考察
        3.7 体外长循环作用考察
        3.8 RBITC-PSSP聚合物胞内转运考察
            3.8.1 RBITC-PSSP聚合物的合成及表征
            3.8.2 共聚焦显微镜观察RBITC-PSSP聚合物的细胞内转运
    4 本章小结
第二章 PAMAM-SS-PEG/DOX复合物的制备及评价
    1 材料与仪器
        1.1 材料
        1.2 仪器
    2 实验方法
        2.1 阿霉素体外分析方法的建立
            2.1.1 阿霉素激发和发射波长的确定
            2.1.2 标准曲线的绘制
            2.1.3 精密度
            2.1.4 回收率试验
        2.2 PSSP/DOX复合物的制备及表征
            2.2.1 投药量的考察
            2.2.2 载药时间的考察
            2.2.3 PSSP/DOX复合物的制备
        2.3 PSSP/DOX复合物的表征
            2.3.1 粒径及Zeta电位测定
            2.3.2 形态观察
            2.3.3 载药量和包封率的测定
        2.4 体外还原及pH敏感释放行为考察
        2.5 PEG对DOX溶解度的影响
    3 结果与讨论
        3.1 阿霉素体外分析方法的建立
            3.1.1 阿霉素激发和发射波长的确定
            3.1.2 标准曲线的绘制
            3.1.3 精密度
            3.1.4 回收率试验
        3.2 PSSP/DOX复合物的制备及表征
            3.2.1 投药量的考察
            3.2.2 载药时间的考察
        3.3 PSSP/DOX复合物的表征
            3.3.1 粒径及Zeta电位测定
            3.3.2 形态观察
            3.3.3 包封率和载药量的测定
        3.4 体外还原及pH敏感释放行为考察
    4 本章小结
第三章 PAMAM-SS-PEG/DOX体内外抗肿瘤活性及其机制研究
    1 材料与仪器
        1.1 材料
        1.2 仪器
        1.3 细胞
        1.4 实验动物
    2 实验方法
        2.1 细胞培养
        2.2 细胞毒性实验
            2.2.1 MTT法测定原理
            2.2.2 实验方法
        2.3 细胞摄取实验
            2.3.1 荧光显微镜定性观察
            2.3.2 流式细胞仪定量分析
        2.4 细胞内药物分布研究
            2.4.1 共聚焦显微镜定性观察
            2.4.2 细胞内药物定量测定
        2.5 细胞摄取机制研究
            2.5.1 内吞抑制剂对细胞摄取的影响
            2.5.2 酸性和还原抑制剂对细胞毒性的影响
        2.6 B16 荷瘤小鼠的体内抗肿瘤活性研究
        2.7 数据统计
    3. 结果与讨论
        3.1 细胞毒性实验
            3.1.1 空白聚合物的细胞毒性
            3.1.2 PSSP/DOX复合物的细胞毒性
        3.2 细胞摄取实验
        3.3 细胞内药物分布研究
            3.3.1 共聚焦显微镜定性观察
            3.3.2 细胞内药物定量测定
        3.4 细胞摄取机制研究
            3.4.1 内吞抑制剂对细胞摄取的影响
            3.4.2 酸性和还原抑制剂对细胞毒性的影响
        3.5 B16 荷瘤小鼠的体内抗肿瘤活性研究
    4 本章小结
第四章 RGD-PEG-SS-PAMAM/DOX体内外抗肿瘤作用研究
    1 材料与仪器
        1.1 材料
        1.2 仪器
        1.3 细胞
        1.4 实验动物
    2 实验方法
        2.1 RGD-PEG-SS-PAMAM聚合物的合成及表征
            2.1.1 RGD-PSSP聚合物的合成
            2.1.2 RGD-PSSP聚合物的结构确证
            2.1.3 粒径和Zeta电位测定
            2.1.4 溶血毒性考察
            2.1.5 血清中稳定性考察
        2.2 RGD-PSSP/DOX复合物的制备及表征
            2.2.1 RGD-PSSP/DOX复合物的制备
            2.2.2 粒径及Zeta电位测定
            2.2.3 形态观察
            2.2.4 包封率和载药量测定
            2.2.5 体外还原及pH敏感释放行为考察
        2.3 最佳RGD配体密度的筛选
        2.4 细胞毒性实验
        2.5 细胞摄取实验
            2.5.1 荧光显微镜定性观察
            2.5.2 流式细胞仪定量分析
        2.6 细胞摄取机制研究
        2.7 B16 荷瘤小鼠的体内抗肿瘤活性研究
        2.8 肿瘤和各主要器官的病理学观察
        2.9 数据统计
    3 结果与讨论
        3.1 RGD-PEG-SS-PAMAM聚合物的合成及表征
            3.1.1 RGD-PSSP聚合物的合成
            3.1.2 RGD-PSSP聚合物的结构确证
            3.1.3 粒径和Zeta电位测定
            3.1.4 溶血毒性考察
            3.1.5 血清中稳定性考察
        3.2 RGD-PSSP/DOX复合物的制备及表征
            3.2.1 复合物的粒径、Zeta电位、载药量及包封率测定
            3.2.2 形态表征
            3.2.3 体外还原及pH敏感释放行为考察
        3.3 最佳RGD配体密度的筛选
        3.4 细胞毒性实验
        3.5 细胞摄取实验
            3.5.1 荧光显微镜定性观察
            3.5.2 流式细胞仪定量分析
        3.6 细胞摄取机制研究
        3.7 B16 荷瘤小鼠的体内抗肿瘤活性研究
        3.8 肿瘤和各主要器官的病理学观察
    4 本章小结
总结与展望
    1 全文总结
    2 研究展望
        2.1 本研究的创新点
        2.2 工作不足与展望
参考文献
攻读博士期间发表的论文
缩略词表
致谢



本文编号：3633960