三种真菌来源的天然产物的发现与挖掘

发布时间：2022-10-03 18:37

　　本文通过改变培养条件、过表达转录调节因子和异源表达的策略,从嗜热毁丝菌Myctlioehthora thermophila和蛹虫草Cordyceps milltaris中发现和分离出了常规实验培养条件下没有的次级代谢产物,并对化合物性质进行了初步抑菌实验和抗肿瘤活性测试。主要的实验结果如下:1、通过改变M thermophila的培养温度,在37℃ PDA培养条件下,分离出了文献中未报道的化合物。在5 L发酵罐中（2个）进行液体发酵共7 L,最后纯化出该化合物。高分辨质谱知道该化合物的分子式为C26H39NO4,分子量为429。核磁检测得出该化合物为MyCyeliothermophin A的衍生物,其在8-C上多了一个-OH,与MyceliothermophinA一样,其对各种肿瘤细胞也有毒性作用。其中对DLD-1的IC50为 1.47 μg/mL,对Hep3B的IC50为1.66 μg/mL,对HepG2的IC50为 1.73μg/mL,对HGC的IC50为0.32 μg/mL。2、利用过表达转录调节因子（TF）的策略,成功激活M thermophila原先沉默的NR-PKS基因簇。... 

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
中文文摘
绪论
    1 嗜热毁丝菌Myceliphthora thermophila和蛹虫草Cordyceps mliltaris简介
        1.1 嗜热毁丝菌M.thermophila
        1.2 蛹虫草C.militaris
    2 天然产物概述
        2.1 天然产物
        2.2 主要天然产物分类
    3 次级代谢基因簇
    4 沉默的基因簇
    5 天然产物基因组挖掘
        5.1 什么是基因组挖掘
        5.2 真菌中天然产物基因组挖掘
        5.3 天然产物基因组挖掘的常用策略
    6 课题研究的目的、主要内容及创新点
        6.1 本课题的研究目的
        6.2 本课题的主要研究内容
        6.3 本课题的创新点
第一章 嗜热毁丝菌 Myceliophthora thermophila的发酵及其代谢产物的分离纯化
    1 前言
    2 实验材料
        2.1 菌株
        2.2 培养基
        2.3 试剂
        2.4 实验仪器
    3 实验方法
        3.1 液体发酵嗜热真菌M.thermophila
        3.2 对发酵产物的分离纯化
            3.2.1 发酵液的萃取
            3.2.2 发酵液的初分离
            3.2.3 利用液相色谱仪分离得到纯品
        3.3 核磁检测样品的处理
        3.4 化合物的抗肿瘤活性测试
    4 结果与分析
        4.1 液体发酵嗜热真菌M.hermophila
        4.2 利用液相色谱仪分离得到纯品
        4.3 化合物1的抗肿瘤活性测试
    5 小结与讨论
第二章 过表达转录调节因子激活M.thermophila的沉默基因簇及其产物分离鉴定
    1 前言
    2 实验材料
        2.1 菌株
        2.2 培养基
        2.3 试剂
        2.4 实验仪器
    3 实验方法
        3.1 M. thermophila基因组的提取
        3.2 M. thermophila原生质体的制备
        3.3 基因的扩增
        3.4 DNA的琼脂糖电泳
        3.5 PCR产物的胶回收
        3.6 载体的双酶切
        3.7 目的片段与载体的连接(T4 Polymerase DNA assembly)
        3.8 大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的制备
        3.9 大肠杆菌感受态细胞的转化
        3.10 大肠杆菌质粒的提取
        3.11 重组克隆载体的验证
        3.12 M.thermophila原生质体的转化
        3.13 表达产物的质谱(LC-MS)检测
        3.14 产物的大规模固体发酵与萃取
        3.15 产物的纯化与结构鉴定
        3.16 产物的抑菌实验测试
    4 结果与分析
        4.1 提取的M.hermophila基因组电泳图
        4.2 目的片段(TF)的PCR电泳图
        4.3 载体的构建
        4.4 M. thermophila的原生质体
        4.5 发酵产物HPLC-MS检测
        4.6 利用液相色谱仪分离得到纯品
        4.7 产物的抑菌实验测试
    5 小结与讨论
第三章 异源表达蛹虫草C.militaris的PKS-NRPS基因簇及其产物分离鉴定
    1 前言
    2 实验材料
        2.1 菌株和质粒
        2.2 培养基
        2.3 试剂
        2.4 实验仪器
        2.5 本实验所用到的per引物
    3 实验方法
        3.1 C.militaris基因组的提取
        3.2 A.nidulans原生质体的制备
        3.3 基因的扩增
        3.4 DNA的琼脂糖电泳和PCR产物的胶回收
        3.5 载体的双酶切
        3.6 酿酒酵母BJ5464感受态的制备
        3.7 酵母感受态细胞的转化(质粒的assembly构建)
        3.8 酵母质粒的提取
        3.9 大肠杆菌感受态细胞的转化及质粒的提取
        3.10 重组克隆载体的验证
        3.11 A.nidulans原生质体的转化
        3.12 表达产物的质谱(LC-MS)检测
        3.13 产物的大规模固体发酵与萃取
        3.14 产物的纯化与结构鉴定
        3.15 产物的抑菌实验测试
        3.16 产物的抗肿瘤测试
    4 结果与分析
        4.1 提取的C.militaris基因组电泳图
        4.2 目的片段的PCR电泳图
        4.3 载体的构建
        4.4 A.nidulans的原生质体
        4.5 发酵产物HPLC-MS检测
        4.6 利用液相色谱仪分离得到纯品
        4.7 产物的抑菌实验测试
        4.8 产物的抗肿瘤活性测试
    5 小结与讨论
第四章 结论与展望
    4.1 结论
    4.2 展望
参考文献
附录
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]蛹虫草研究和开发过程中的一些问题和展望[J]. 文庭池,查岭生,康冀川,Kevin D.HYDE.  菌物学报. 2017(01)
[2]蛹虫草化学成分及药理作用研究进展[J]. 樊慧婷,林洪生.  中国中药杂志. 2013(15)



本文编号：3684611