棒状链霉菌中克拉维酸合成相关调控基因的筛选及功能研究

发布时间：2022-10-27 20:40

　　背景:β-内酰胺类抗生素的长期广泛使用导致了大量耐药菌株的产生,而这些耐药菌的主要耐药机制是产生β-内酰胺酶,使β-内酰胺类抗生素降解失活。克拉维酸作为一种广谱β-内酰胺酶抑制剂已广泛应用于临床治疗β-内酰胺类抗生素耐药菌的感染。克拉维酸的主要生产菌株为棒状链霉菌。目前关于棒状链霉菌中初级代谢和次级代谢与克拉维酸合成之间的调控机制尚未十分明朗。目的:（1）发现棒状链霉菌中调控克拉维酸合成的调控基因;（2）阐明新发现调控基因的调控功能和调控途径。方法:采用同源重组双交换法构建调控基因的敲除突变株。同时采用固体发酵的生物活性检测法和液体发酵的HPLC法检测突变菌株的克拉维酸产量变化情况,从而发现调控CA合成的调控基因。随后,采用液体发酵分析、转录组比较分析和RT-qPCR分析调控基因的调控功能,采用ChIP-seq和EMSA等技术分析调控基因的靶基因。结果:（1）双组份信号传导系统基因orf1717/1718敲除可显著影响克拉维酸的生物合成,且在不同发酵条件下影响结果不同。（2）转录组及RT-qPCR分析显示△1717/1718菌株的脂肪酸降解、精氨酸合成及氧化磷酸化的多种初级代谢途径和克... 

【文章页数】：105 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一部分 前言
    1.1 克拉维酸介绍
    1.2 克拉维酸生物合成相关的基因簇
        1.2.1 克拉维酸基因簇
        1.2.2 克拉维烷基因簇
        1.2.3 旁系同源基因簇
    1.3 克拉维酸的生物合成途径
    1.4 克拉维酸生物合成的调控
        1.4.1 途径特异性调控基因
        1.4.2 γ-丁内酯信号途径
        1.4.3 σ因子调控系统
        1.4.4 其他调控机制
    1.5 双组份信号转导系统
    1.6 本研究拟解决的问题
第二部分 影响CA合成的调控基因
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 菌株
        2.1.2 质粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 培养基
        2.1.5 主要试剂及配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 链霉菌产孢培养
        2.2.2 链霉菌孢子收集及保存
        2.2.3 链霉菌总DNA提取的菌丝体培养与收集
        2.2.4 链霉菌总DNA提取
        2.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳
        2.2.6 大肠杆菌质粒DNA的提取
        2.2.7 DNA的琼脂糖凝胶回收
        2.2.8 大肠杆菌感受态细胞制备
        2.2.9 大肠杆菌热击转化
        2.2.10 基因敲除质粒构建
        2.2.11 大肠杆菌与链霉菌间接合转移
        2.2.12 链霉菌基因敲除突变菌株PCR筛选验证
        2.2.13 CA产量的生物活性检测
        2.2.14 链霉菌CA液体发酵培养
        2.2.15 CA的HPLC检测
    2.3 实验结果
        2.3.1 链霉菌总DNA提取
        2.3.2 基因敲除质粒构建
        2.3.3 基因敲除菌株构建
        2.3.4 基因敲除菌株的CA固体发酵及检测
        2.3.5 基因敲除菌株的CA液体发酵及检测
    2.4 讨论
第三部分 orf1717/1718对CA生物合成调控的分析
    3.1 材料与试剂
        3.1.1 菌株
        3.1.2 质粒
        3.1.3 引物
        3.1.4 培养基
        3.1.5 主要试剂及配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 链霉菌CA液体发酵培养与收集
        3.2.2 pHLY-1717超表达质粒构建
        3.2.3 CA的HPLC检测
        3.2.4 转录组测序及分析
        3.2.5 链霉菌总RNA提取
        3.2.6 RT-qPCR
    3.3 实验结果
        3.3.1 orf1717超表达菌株构建
        3.3.2 △1717/1718和orf1717超表达菌株的液体发酵分析
        3.3.3 液体发酵条件下的转录组分析
        3.3.4 CA合成相关基因的RT-qPCR分析
    3.4 讨论
第四部分 orf1717调控的靶基因分析
    4.1 材料与试剂
        4.1.1 菌株
        4.1.2 质粒
        4.1.3 引物
        4.1.4 培养基
        4.1.5 主要试剂及配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 链霉菌ChIP-seq用菌丝体培养与收集
        4.2.2 1717 His重组蛋白的表达质粒构建
        4.2.3 重组蛋白1717His的表达纯化及抗体制备
        4.2.4 pSET-1717Flag融合质粒的构建
        4.2.5 Westernblot(蛋白质免疫印迹)实验
        4.2.6 ChIP-seq(染色质免疫共沉淀)实验
        4.2.7 EMSA(凝胶迁移/凝胶阻滞电泳)实验
    4.3 实验结果
        4.3.1 重组蛋白1717His的表达纯化
        4.3.2 棒状链霉菌1717Flag融合菌株的构建
        4.3.3 棒状链霉菌中ORF1717蛋白在发酵过程中的表达情况分析
        4.3.4 棒状链霉菌1717Flag融合菌株的ChIP-seq
        4.3.5 1717 His蛋白与启动子的EMSA分析
    4.4 讨论
第五部分 结论与展望
参考文献
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]转录组分析棒状链霉菌F613-1高产克拉维酸的分子基础[J]. 覃荣活,付加芳,宗工理,王志宇,曹广祥.  生物技术通报. 2017(09)
[2]克拉维酸叔丁胺丙酮溶剂化物的研究[J]. 张晓晓,靳孝庆,唐云峰,曹广祥.  广东化工. 2015(15)
[3]棒状链霉菌控制抗生素合成的调节机制[J]. 朱碧银,洪文荣.  国外医药(抗生素分册). 2010(06)
[4]β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸研究进展[J]. 孟勇,张国华,王忠彦,官家发.  中国抗生素杂志. 2003(01)



本文编号：3697177