重组腺病毒表达抗癌肽ANP对舌鳞状细胞癌抑癌作用的研究

发布时间：2023-03-16 19:24

　　抗癌肽是一类小分子多肽类新型抗癌药物,通过破坏肿瘤细胞膜结构、抑制癌细胞增殖和迁移以及肿瘤血管的形成等达到对癌细胞杀伤作用,而对正常细胞的毒性较低,是目前抗肿瘤新药研究的一大热点。研究发现心房利钠肽ANP(Atrial natriuretic peptide)来源的心房肽类激素可以强力抑制癌细胞DNA的合成,从而抑制癌细胞的生长,而对正常的人体细胞无损伤;它还可以缓解抗癌药物对肾脏、肝脏的毒性作用。在癌组织细胞表达ANP既可以解决多肽类药物半衰期短的问题,也可以避免对其他细胞的副作用。采用基因治疗的策略,用重组腺病毒感染哺乳动物细胞分泌表达抗癌肽ANP,使ANP与癌细胞“亲密接触”,克服抗癌药物不易到达靶点的缺点,同时可以在癌症组织细胞持续表达抗癌肽ANP,达到高效杀灭癌细胞的目的。本研究根据ANP的cDNA序列设计特异性引物,通过提取细胞内RNA,逆转录得到cDNA,PCR得到ANP基因。设计携带Igκ信号肽的重叠PCR引物,重叠PCR获得Igκ信号肽基因,将ANP基因和Igκ信号肽基因通过重叠PCR获得IgANP基因。将ANP与IgANP基因连接T载体经测序鉴定正确后,分别将ANP...

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 抗癌肽的概述
    1.2 ANP的简介
        1.2.1 ANP的来源
        1.2.2 ANP的作用机理
    1.3 腺病毒的简介
    1.4 本研究的目的和意义
第二章 重组腺病毒载体的构建和重组腺病毒的包装
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验细胞、菌株
        2.1.2 质粒
        2.1.3 实验试剂及耗材
        2.1.4 实验仪器设备
        2.1.5 培养基及各试剂配方
        2.1.6 相关缓冲液和其它试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 ANP和 Ig ANP基因的获得
        2.2.2 ANP和 Ig ANP基因穿梭载体的构建
        2.2.3 BJ5183 同源重组构建重组腺病毒载体pAdEasy-ANP
        2.2.4 重组腺病毒载体转染293A细胞获得重组腺病毒
        2.2.5 重组腺病毒的质量控制
    2.3 实验结果
        2.3.1 ANP基因的PCR扩增
        2.3.2 重叠PCR获取IgANP基因
        2.3.3 克隆载体的提取
        2.3.4 克隆载体双酶切鉴定
        2.3.5 克隆载体和腺病毒穿梭空载体双酶切回收
        2.3.6 腺病毒穿梭载体的提取
        2.3.7 腺病毒穿梭载体载体双酶切鉴定
        2.3.8 腺病毒穿梭载体的单酶切线性化及回收
        2.3.9 腺病毒表达载体的提取
        2.3.10 腺病毒表达载体单酶切鉴定
        2.3.11 腺病毒表达载体转DH5α提质粒
        2.3.12 腺病毒表达载体转DH5α质粒酶切鉴定
        2.3.13 重组腺病毒的的包装
        2.3.14 重组腺病毒的PCR鉴定
        2.3.15 重组腺病毒的质量控制
    2.4 小结
第三章 重组腺病毒表达抗癌肽ANP对舌癌细胞的作用效果
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验细胞
        3.1.2 主要实验试剂
        3.1.3 培养基及各试剂配方
        3.1.4 主要实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 感染复数的确定
        3.2.2 RT-PCR检测重组腺病毒在舌癌细胞中表达检测
        3.2.3 免疫荧光实验鉴定重组腺病毒在舌癌细胞中的表达
        3.2.4 MTT细胞相对活性检测
        3.2.5细胞克隆形成实验
        3.2.6 细胞划痕实验测定细胞迁移率
        3.2.7 流式细胞仪检测周期
        3.2.8 流式细胞仪检测凋亡
        3.2.9 Western Blot检测凋亡相关蛋白表达
        3.2.10 统计学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 感染复数的确定
        3.3.2 RT-PCR检测ANP的表达
        3.3.3 免疫荧光鉴定ANP的表达
        3.3.4 MTT检测细胞相对活性
        3.3.5克隆形成实验
        3.3.6 细胞划痕实验测定细胞迁移率
        3.3.7 流式细胞仪检测周期
        3.3.8 流式检测细胞凋亡
        3.3.9 Western Blot检测凋亡相关蛋白表达情况
    3.4 小结
第四章 结论与讨论
    4.1 重组腺病毒载体的构建和重组腺病毒的包装
    4.2 重组腺病毒表达抗癌肽ANP对舌癌细胞的抑制效果
参考文献
致谢
附录



本文编号：3763169