双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗作用

发布时间：2017-05-18 15:07

  本文关键词：双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是发生在脊髓椎管神经元剧烈地创伤性损伤导致暂时或永久性的知觉及运动功能缺损。成年哺乳动物中枢神经系统(Central nervous system,CNS)受损后其轴突生长受到抑制而影响其神经再生及功能的自我修复,而外周神经系统神经纤维受损后却能进行自我修复并恢复其功能。影响CNS损伤修复和再生的因素很多,一方面是因为神经纤维生长能力受限、胶质瘢痕的形成及神经营养因子缺乏等多种因素致使损伤轴突再生困难;另一方面是由于损伤的中枢微环境中髓磷脂相关抑制因子(Myelin associated inhibitors,MAIs)及其受体的大量存在,进而介导髓磷脂抑制信号的传递。因此,通过直接干预MAIs抑制信号的传递促进神经再生,可能作为针对脊髓损伤行之有效的治疗方法之一。作为MAIs的共同受体,Nogo受体(Nogo-66 receptor,Ng R)和成对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B,Pir B)能介导MAIs抑制信号的传递,因此,抑制Ng R和Pir B可能会促进神经轴突再生和保护神经元生长锥完整,进而发挥神经再生的促进效应。核酸疫苗作为一种新的免疫治疗策略近年来已被广泛应用于各种疾病的治疗研究,而人GM-CSF具有增强机体免疫应答和促进T细胞增殖的能力,是一种重要细胞因子佐剂,同时,GM-CSF还具有神经保护作用,可激活神经干、祖细胞且抑制胶质瘢痕的形成。为探讨GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用,本研究采用基因工程方法分别克隆Ng R、Pir B和GM-CSF基因片段,构建pc DNA-GMCSF-Ng R-Pir B真核表达载体,然后与脂质体一起形成复合核酸疫苗。免疫大鼠后通过免疫学、行为学及组织学等方法探讨GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗对损伤脊髓的修复作用及运动功能的改善情况,为中枢神经轴突再生的免疫治疗提供理论依据和实践基础。主要研究内容:1.真核表达载体的构建与鉴定及体外表达检测PCR扩增共表达GM-CSF、Ng R及Pir B目的基因片段,分别亚克隆至pc DNA3.1(+)质粒中,构建重组真核表达载体pc DNA-GMCSF-Ng R-Pir B,并进行PCR、酶切及基因测序鉴定。重组质粒通过脂质体法体外转染CHO细胞并用免疫荧光法检测Ng R和Pir B蛋白的体外表达情况。2.制备GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗将脂质体与GMCSF-Ng R-Pir B重组质粒以1:1的体积比混合后形成核酸疫苗,以SD大鼠为研究对象,肌肉注射连续免疫6w,期间每周检测免疫血清中抗体的效价。同时观察动物体重及行为学改变情况,评价疫苗免疫能否引起大鼠变态性脑脊髓炎。3.双靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用核酸疫苗连续免疫6w后,制备脊髓左侧半横切损伤动物模型,并分别从行为学、组织学及分子水平评价GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗对轴突再生及运动功能改善的促进作用。主要结果及结论:1.成功构建了GMCSF、Ng R和Pir B共表达的真核表达载体。2.制备了双靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗及SD大鼠左侧半横切脊髓损伤动物模型。3.双靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗能刺激机体免疫系统产生特异性抗体,中和内源性Ng R及Pir B,有效逆转中枢神经系统Ng R和Pir B介导的髓磷脂再生抑制信号的传递,促进受损脊髓神经纤维的修复及运动功能的改善。
【关键词】：NgR PirB 核酸疫苗 脊髓损伤 轴突再生
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩写标注10-12
• 绪论12-18
• 1 核酸疫苗对脊髓损伤的免疫治疗策略12-13
• 2 髓磷脂抑制因子受体-NgR和Pir B13-17
• 2.1 NgR13-14
• 2.2 PirB14-17
• 3 GM-CSF细胞因子佐剂及其对中枢神经损伤的修复作用17-18
• 第一章 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB真核表达载体的构建及鉴定18-38
• 1 实验材料18-21
• 1.1 质粒载体18
• 1.2 菌株18
• 1.3 引物设计合成18-19
• 1.4 细胞系19
• 1.5 主要实验仪器19-20
• 1.6 主要试剂20-21
• 1.7 主要试剂配制21
• 2 实验方法21-30
• 2.1 DH5α感受态细胞制备21
• 2.2 双靶向pcDNA-GMCSF-NgR-PirB真核表达载体的构建21-28
• 2.3 双靶向pcDNA-GMCSF-NgR-PirB真核表达载体的鉴定28-30
• 3 实验结果30-36
• 3.1 GMCSF、NgR及PirB目的基因扩增30-31
• 3.2 阳性克隆鉴定31-35
• 3.3 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB重组质粒体外表达检测35-36
• 4 小结36-38
• 第二章 双靶向GMCSF-NgR-PirB疫苗对损伤脊髓免疫治疗作用38-64
• 1 实验材料38-41
• 1.1 实验主要试剂38-39
• 1.2 实验主要器材39
• 1.3 试剂配制39-40
• 1.4 质粒40-41
• 1.5 实验动物41
• 2 实验方法41-49
• 2.1 制备双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗41
• 2.2 双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗免疫动物41-42
• 2.3 双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗体内免疫学活性检测42-43
• 2.4 实验SD大鼠变态性脑脊髓炎的发生率检测43
• 2.5 SCI动物模型的制备43
• 2.6 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓治疗的行为学评价43-44
• 2.7 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓治疗的组织学评价44-48
• 2.8 双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗体内质粒残留检测48-49
• 2.9 数据结果统计49
• 3 结果分析49-63
• 3.1 双靶向GMCSF-NgR-PirB复合核酸疫苗免疫产生的抗体效价49-50
• 3.2 实验SD大鼠变态性脑脊髓炎的发生率检测50-51
• 3.3 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓治疗的行为学评价51-55
• 3.4 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓治疗的组织学评价55-61
• 3.5 双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗体内质粒残留61-63
• 4 小结63-64
• 讨论64-68
• 全文总结68-70
• 致谢70-72
• 参考文献72-78
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果78-79

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 丁霞;陆兵;夏杰;徐殿胜;;核酸疫苗载体pVAX-44质粒高拷贝研究[J];化学与生物工程;2008年06期

2 李岩;夏杰;陆兵;徐殿胜;;HCGβ抗肿瘤核酸疫苗的纯化工艺[J];华东理工大学学报(自然科学版);2008年05期

3 胥全彬,任冽,张艳红,黄维,靳彦文,李晓荣,李平,钟辉,刘传暄,马清钧,曹诚;一种新型疟疾核酸疫苗生产工艺的初步研究[J];中国生物工程杂志;2005年05期

4 陈洁;刘思弘;;“破茧”法则——记塔瑞莎公司跻身世界顶尖核酸疫苗领域[J];浦东开发;2013年11期

5 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 魏战勇;崔保安;王学斌;徐端红;;核酸疫苗研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（上）[C];2003年

2 温建新;王金宝;;核酸疫苗的应用研究进展[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年

3 秦爱建;刘红梅;许小琴;;2005全国第二届核酸疫苗研讨会专刊[A];2005全国第二届核酸疫苗研讨会论文集[C];2005年

4 林天龙;俞伏松;杨金先;龚晖;;核酸疫苗研究及其应用前景[A];福建省科协首届学术年会卫星会议——畜牧业持续发展对策学术研讨会论文集[C];2001年

5 邵杰;梁争论;;核酸疫苗研究进展[A];2013年中国药学大会暨第十三届中国药师周论文集[C];2013年

6 刘克洲;;核酸疫苗的研究现状和临床应用前景[A];第九次全国中西医结合肝病学术会议论文集[C];2000年

7 秦晓冰;金宁一;付明山;马鸣潇;尹革芬;金扩世;李昌;;猪2型圆环病毒核酸疫苗的构建、鉴定和表达[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年

8 朱明昭;宋国兴;;单纯疱疹病毒1型糖蛋白D真核表达质粒的构建、表达及其作为核酸疫苗的初步研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

9 刘辉;朱平;林宁晶;张英;卜定方;王奕嘉;;家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗的构建及表达的研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

10 何宏轩;王承民;张西臣;;微小隐孢子虫核酸疫苗的研究[A];科技、工程与经济社会协调发展——河南省第四届青年学术年会论文集（下册）[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 翟望;核酸疫苗研究进展[N];保健时报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘东旭;水貂阿留申病毒的分离鉴定和五种核酸疫苗的构建及免疫原性研究[D];吉林农业大学;2016年

2 王加才;人类α-突触核蛋白核酸疫苗的构建及其神经保护作用[D];重庆医科大学;2008年

3 朱明昭;细胞因子基因佐剂增强单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗的保护性免疫应答的研究[D];中国协和医科大学;2003年

4 赵小宁;丙型肝炎病毒核心区核酸疫苗的构建及其免疫小鼠的初步研究[D];第四军医大学;1998年

5 章亚男;乙型肝炎核酸疫苗的安全性研究[D];第二军医大学;2005年

6 曾韦锟;幽门螺杆菌粘膜核酸疫苗的制备及免疫学效应研究[D];第三军医大学;2005年

7 徐灿;幽门螺杆菌尿素酶B和黏附素A核酸疫苗的研究[D];第二军医大学;2004年

8 戴文佳;肺炎球菌溶血素核酸疫苗的制备及其免疫原性研究[D];复旦大学;2008年

9 何宏轩;隐孢子虫核酸疫苗的研究[D];中国人民解放军军需大学;2002年

10 高娜;日本脑炎病毒核酸疫苗的构建及免疫原性研究[D];第三军医大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 田格如;陕西部分地区鸡肠道寄生虫感染状况及隐孢子虫核酸疫苗研究[D];西北农林科技大学;2016年

2 李曼;刚地弓形虫WH3-GRA15-GFP核酸疫苗免疫保护作用的研究[D];安徽医科大学;2016年

3 梁霄勇;牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其E0核酸疫苗与细胞因子佐剂联合免疫研究[D];新疆农业大学;2016年

4 刘芳;鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗免疫效力研究[D];安徽农业大学;2015年

5 肖岚;双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗作用[D];重庆理工大学;2016年

6 高爽;白色念珠菌热休克蛋白90核酸疫苗的构建及其免疫学活性研究[D];东北师范大学;2011年

7 黄莺;丙型肝炎核酸疫苗的构建及其诱导小鼠免疫效果的评价[D];第四军医大学;2001年

8 杨云鹏;优化hα-syn核酸疫苗免疫反应效果及安全性的评价[D];重庆医科大学;2012年

9 赵飞骏;梅毒螺旋体外膜蛋白核酸疫苗的筛选构建及其免疫效果的比较研究[D];南华大学;2005年

10 郭丽姝;艾滋病疫苗（核酸疫苗）的质量研究[D];吉林大学;2007年

  本文关键词：双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：376363