新型化合物XN51对急性粒细胞白血病细胞的作用与其影响热休克蛋白90功能的关系

发布时间：2017-05-19 11:05

  本文关键词：新型化合物XN51对急性粒细胞白血病细胞的作用与其影响热休克蛋白90功能的关系，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的研究新型化合物XN51对急性粒细胞白血病(AML)细胞增殖抑制作用及其干扰热休克蛋白90(Hsp90)功能的关系。方法(1)采用台盼蓝染色活细胞计数和MTT方法检测XN51在体外抑制AML细胞增殖作用。(2)采用流式细胞术检测XN51对AML细胞周期时相、线粒体膜电位(MMP)和细胞凋亡的影响。(3)蛋白免疫印迹(Western blot)探讨XN51对AML细胞周期和细胞凋亡相关蛋白表达的影响。(4)孔雀绿磷钼酸铵——无机磷检测法检测XN51对HSP90蛋白ATP酶活性的影响。(5)蛋白免疫印迹法检测XN51对AML细胞Hsp90客户蛋白Akt和CDK2表达的影响。结果(1)台盼蓝染色实验和MTT实验结果表明XN51具有明显抑制AML细胞HL-60和NB4增殖的作用,半数抑制率浓度IC50分别为(3.49±0.02)μmol·L-1和(2.52±0.04)μmol·L-1,且其体外抑制AML细胞增殖的活性比Nov提高了近100倍。(2)流式细胞术结果表明XN51明显增加HL-60和NB4细胞S期细胞的比例,使AML细胞周期阻滞在细胞周期S期;XN51能显著降低AML细胞线粒体膜电位水平;随着XN51浓度的增加,HL-60和NB4细胞的凋亡比例明显增加;XN51破坏了AML细胞线粒体的稳定性和增加AML细胞的凋亡率表明XN51通过激活细胞线粒体凋亡途径诱导AML细胞发生程序性死亡或坏死;XN51处理AML细胞诱导Hsp70蛋白表达,增加细胞内Cleaved parp、Cleaved Caspase3和Cleaved Caspase9蛋白蛋白含量,而下调p-Akt和CDK2蛋白的表达水平。(3)孔雀绿磷钼酸铵——无机磷实验结果表明XN51和Hsp90抑制剂GA(阳性对照药)均能显著抑制Hsp90 ATPase酶活性,表现为使Hsp90内源荧光发生规律性淬灭。通过Stern—Volmer方程计算得出XN51对Hsp90ATPase作用的动态淬灭速率常数Kq值为(4.45±0.70x1012)L?mol-1?s-1远大于各类淬灭剂对生物大分子最大扩散控制的碰撞动态淬灭速率常数Kq(2.0x1010L?mol-1?s-1),表明XN51是通过与Hsp90形成复合物引起Hsp90内源荧光发生静态淬灭达到体外抑制Hsp90 ATPase的催化活性的作用;XN51通过抑制Hsp90分子伴侣功能,使Akt蛋白不能形成正确稳定的活性构象而被蛋白酶体降解,达到抑制AML细胞增殖作用;XN51通过抑制Hsp90分子伴侣功能,使CDK2蛋白不能形成正确稳定的构象结构而被蛋白酶体降解,使AML细胞周期阻滞在S期;XN51在抑制Hsp90功能的同时使Hsp90的辅伴侣分子Hsp70蛋白表达上调。结论新型化合物XN51通过与Hsp90结合,干扰Hsp90分子伴侣功能,使参与细胞周期和增殖相关的Hsp90客户蛋白Akt和CDK2不能正确折叠修饰形成有效稳定的生物学构象而失活,依赖蛋白酶体通路在细胞内被降解清除,使AML细胞周期进程不能通过S期细胞周期检测点,诱导AML细胞阻滞在细胞周期的S期;XN51通过破坏线粒体膜电位的稳定性,激活AML细胞线粒体凋亡通路,激活AML细胞内Caspase级联反应,诱导AML细胞发生凋亡,抑制AML细胞增殖。
【关键词】：Hsp90 静态淬灭 分子伴侣 细胞周期阻滞 凋亡
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 英文缩略词表11-12
• 前言12-13
• 1. XN51对AML细胞增殖的抑制作用13-28
• 1.1 XN51的化学合成13-15
• 1.1.1 材料、试剂13
• 1.1.2 实验仪器13-14
• 1.1.3 实验方法14-15
• 1.1.3.1 药物合成14
• 1.1.3.2 药物纯化14-15
• 1.2 台盼蓝染色活细胞计数15-17
• 1.2.1 材料、试剂15
• 1.2.2 细胞株及培养条件15
• 1.2.3 主要试剂的配制15
• 1.2.4 实验仪器15-16
• 1.2.5 实验方法16
• 1.2.6 实验结果16-17
• 1.3 MTT法检测XN51对AML细胞增殖抑制作用17-20
• 1.3.1 材料、试剂17
• 1.3.2 细胞株及培养条件17-18
• 1.3.3 主要试剂的配制18
• 1.3.4 实验仪器18
• 1.3.5 实验方法18-19
• 1.3.6 实验结果19-20
• 1.4 XN51对AML细胞周期、线粒体膜电位和细胞凋亡的影响20-27
• 1.4.1 材料、试剂21
• 1.4.2 细胞株及培养条件21
• 1.4.3 主要试剂的配制21-22
• 1.4.4 实验仪器22
• 1.4.5 实验方法22-23
• 1.4.5.1 碘化丙啶染色流式细胞仪检测细胞周期22
• 1.4.5.2 JC-1 染色检测XN51对AML细胞线粒体膜电位的影响22-23
• 1.4.5.3 流式细胞仪检测XN51对AML细胞凋亡的影响23
• 1.4.6 实验结果23-27
• 1.4.6.1 XN51使HL-60和NB4细胞周期阻滞在S期23-25
• 1.4.6.2 XN51降低HL-60和NB4细胞线粒体膜电位25-26
• 1.4.6.3 XN51增加HL-60和NB4细胞凋亡比例26-27
• 1.5 统计分析27
• 1.6 讨论和结论27-28
• 1.6.1 讨论27-28
• 1.6.2 结论28
• 2 XN51抑制AML细胞增殖与其影响Hsp90功能的关系28-42
• 2.1 XN51对AML细胞周期及凋亡相关蛋白表达的影响28-34
• 2.1.1 材料、试剂29
• 2.1.2 细胞株及培养条件29
• 2.1.3 主要试剂的配制29-31
• 2.1.4 实验仪器31
• 2.1.5 实验方法31-33
• 2.1.5.1 提取总蛋白31-32
• 2.1.5.2 BCA蛋白定量32
• 2.1.5.3 蛋白免疫印迹32-33
• 2.1.6 实验结果33-34
• 2.2 (孔雀绿磷钼酸铵——无机磷检测法)检测XN51对HSP90蛋白ATP酶活性的影响34-36
• 2.2.1 材料、试剂34
• 2.2.2 主要试剂的配制34-35
• 2.2.3 实验仪器35
• 2.2.4 实验方法35-36
• 2.2.4.1 Hsp90蛋白的表达和纯化35
• 2.2.4.2 荧光滴定法检测XN51对Hsp90内源荧光的淬灭作用35-36
• 2.2.5 实验结果36
• 2.3 XN51对Hsp90客户蛋白的影响36-38
• 2.3.1 实验原理和材料36-37
• 2.3.2 实验试剂37
• 2.3.3 试验方法37
• 2.3.4 实验结果37-38
• 2.4 统计分析38
• 2.5 讨论和结论38-42
• 2.5.1 讨论38-40
• 2.5.2 结论40-42
• 参考文献42-46
• 文献综述46-53
• 参考文献50-53
• 致谢53

【共引文献】

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