新型硒化卡拉胶降解酶制剂及其应用研究

发布时间：2023-04-29 20:53

　　本论文利用硒化卡拉胶开发海藻硒寡糖,建立环保的生物酶解新工艺技术,生产安全高效的海藻硒寡糖新产品,为其作为肿瘤治疗辅助药品、海洋特医食品、食品添加剂和饲料添加剂奠定基础。本课题从海藻中分离出一株新型硒化卡拉胶降解菌株,并对该硒化卡拉胶酶及其酶制剂的制备工艺、酶学性质、降解特性、细胞毒性及稳定性进行研究。本课题首次对产硒化卡拉胶酶菌株筛选、发酵工艺及其酶学性质进行研究:筛选得到的产酶菌株经16S rDNA鉴定为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.);对其采用单因素和响应面法进行菌株的发酵工艺研究,最佳工艺条件为:1.59%κ-卡拉胶、3.69 mmol/L Ca²⁺、33℃,所产生的酶活力值可达8.495 U/m L;并考察温度、pH、金属离子、表面活性剂、蛋白抑制剂等对其酶学性质的影响。采用真空冷冻干燥法和固定化方法获得理想的新型硒化卡拉胶酶制剂。首先探讨了真空冷冻干燥法制备固体冻干酶制剂的方法,以相对酶活为指标,得到最佳冻干工艺条件:预冻温度-40℃、海藻糖浓度2.0%、酶液厚度5 mm、预冻时间10 h,所制得冻干酶制剂的剩余酶活达53....

【文章页数】：97 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 综述
    1.1 卡拉胶概述
        1.1.1 卡拉胶的来源和结构
        1.1.2 卡拉胶酶的研究进展
    1.2 酶制剂的概况
        1.2.1 酶制剂的定义
        1.2.2 固定化的方法概述
            1.2.2.1 固定化载体
            1.2.2.2 固定化的方法
        1.2.3 酶制剂的应用
            1.2.3.1 饲料行业的应用
            1.2.3.2 食品工业的应用
            1.2.3.3 纺织工业的应用
        1.2.4 酶制剂的国内外研究热点
            1.2.4.1 基因工程技术
            1.2.4.2 模拟酶
            1.2.4.3 抗体酶
    1.3 硒多糖概述
        1.3.1 硒多糖的来源
        1.3.2 硒的存在形态
        1.3.3 分析方法
    1.4 研究意义
第二章 产硒化卡拉胶酶菌株的筛选及多样性分析
    2.1 试验材料
        2.1.1 试剂
        2.1.2 仪器
        2.1.3 培养基
    2.2 试验方法
        2.2.1 产硒化卡拉胶酶降解菌株的筛选
        2.2.2 产硒化卡拉胶酶降解菌株的菌种鉴定
        2.2.3 DNS法（3,5-二硝基水杨酸）测定硒化卡拉胶酶活性
            2.2.3.1 半乳糖标准曲线
            2.2.3.2 硒化卡拉胶酶活的测定
        2.2.4 新型硒化卡拉胶降解酶的定位
            2.2.4.1 胞内酶的提取
            2.2.4.2 胞外酶的提取
            2.2.4.3 降解酶的定位
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 硒化卡拉胶酶活性菌株的筛选与鉴定
        2.3.2 产硒化卡拉胶酶菌株的形态观察和菌种鉴定
        2.3.3 新型硒化卡拉胶降解菌株的定位
    2.4 本章小结
第三章 产硒化卡拉胶酶菌株发酵条件的优化
    3.1 试验材料
        3.1.1 试剂
        3.1.2 仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 酶活的测定方法
        3.2.2 响应面法优化菌株Pseudoalteromonas sp. Xi13发酵条件
            3.2.2.1 单因素试验
            3.2.2.2 响应面试验设计
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 单因素实验
            3.3.1.1 温度对Pseudoalteromonas sp. Xi13菌株产酶的影响
            3.3.1.2 pH对Pseudoalteromonas sp. Xi13菌株产酶的影响
            3.3.1.3 碳源对Pseudoalteromonas sp. Xi13菌株产酶的影响
            3.3.1.4 氮源对Pseudoalteromonas sp. Xi13菌株产酶的影响
            3.3.1.5 金属离子对Pseudoalteromonas sp. Xi13菌株产酶的影响
            3.3.1.6 接种量对Pseudoalteromonas sp. Xi13菌株产酶的影响
            3.3.1.7 摇瓶转速对Pseudoalteromonas sp. Xi13菌株产酶的影响
        3.3.2 响应面试验结果
        3.3.3 响应面设计试验验证结果
    3.4 本章小结
第四章 硒化卡拉胶酶酶学性质的研究
    4.1 试验材料
        4.1.1 试剂
        4.1.2 仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 硒化卡拉胶酶液的制备方法
        4.2.2 硒化卡拉胶酶活力的测定方法
        4.2.3 硒化卡拉胶酶的降解曲线
        4.2.4 硒化卡拉胶酶酶学性质的研究
            4.2.4.1 硒化卡拉胶酶的最适反应温度
            4.2.4.2 硒化卡拉胶酶的最适p H
            4.2.4.3 金属离子对硒化卡拉胶酶活性的影响
            4.2.4.4 蛋白抑制剂、变性剂及表面活性剂对硒化卡拉胶酶活性的影响
            4.2.4.5 硒化卡拉胶酶的底物特异性
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 硒化卡拉胶酶降解曲线
        4.3.2 硒化卡拉胶酶的最适反应温度研究
        4.3.3 硒化卡拉胶酶的最适p H的研究
        4.3.4 金属离子对硒化卡拉胶酶活性的影响
        4.3.5 蛋白抑制剂、变性剂及表面活性剂对活性的影响
        4.3.6 硒化卡拉胶酶的底物特异性
    4.4 本章小结
第五章 硒化卡拉胶酶制剂
    5.1 实验材料
        5.1.1 试剂
        5.1.2 仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 硒化卡拉胶酶制剂的制备流程
            5.2.1.1 硒化卡拉胶酶液的制备
            5.2.1.2 硒化拉胶酶液的除菌
            5.2.1.3 固体酶制剂干燥方法的选择
        5.2.2 真空冷冻干燥法制备固体酶制剂
            5.2.2.1 真空冷冻干燥工艺研究
            5.2.2.2 固体酶制剂的酶学性质初步研究
            5.2.2.3 固体酶制剂贮存稳定性研究
        5.2.3 硒化卡拉胶酶的固定化方法研究
            5.2.3.1 交联－包埋－交联法
            5.2.3.2 硒化卡拉胶固定化酶制剂的稳定性研究
    5.3 实验结果与分析
        5.3.1 真空冷冻干燥法制备固体酶制剂
            5.3.1.1 酶液干燥方法的选择
            5.3.1.2 真空冷冻干燥工艺优化
            5.3.1.3 固体酶制剂的酶学性质初步研究
            5.3.1.4 真空冷冻干燥酶制剂贮存稳定性
        5.3.2 硒化卡拉胶酶的固定化研究
            5.3.2.1 固定化酶条件选择
            5.3.2.2 固定化酶颗粒的形态
            5.3.2.3 硒化卡拉胶固定化酶的稳定性研究
        5.3.3 酶制剂的降解性能
    5.4 本章小结
第六章 新型硒化卡拉胶降解酶制剂的应用
    6.1 材料与仪器
        6.1.1 试剂
        6.1.2 仪器
    6.2 实验内容
        6.2.1 生物酶解法制备硒寡糖
        6.2.2 硒寡糖含硒量的测定
            6.2.2.1 实验原理
            6.2.2.2 硒含量标准曲线
            6.2.2.3 实验方法
        6.2.3 硒寡糖薄层层析分析
        6.2.4 硒寡糖理化性质研究
            6.2.4.1 硒寡糖稳定性的测定
            6.2.4.2 硒寡糖黏度测定
            6.2.4.3 硒寡糖溶解性的测定
        6.2.5 检测硒寡糖对细胞的作用
    6.3 实验结果与分析
        6.3.1 紫外分光光度法的方法学建立
            6.3.1.1 检测波长的确定
            6.3.1.2 硒标准曲线
            6.3.1.3 精密度
            6.3.1.4 加标回收率实验
            6.3.1.5 稳定性试验
        6.3.2 硒寡糖含硒量的测定
            6.3.2.1 有机硒和无机硒的分离方法
            6.3.2.2 硒含量的测定
        6.3.3 TLC分析酶解产物
            6.3.3.1 灵敏度
            6.3.3.2 酶解产物
        6.3.4 硒寡糖的理化性质
        6.3.5 细胞试验
    6.4 本章小结
结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文



本文编号：3805722