基于ALI的r-PA/SP-B的融合表达及功能研究

发布时间：2023-06-03 02:33

　　肺表面活性蛋白B(SP-B)来源于肺泡II型上皮细胞,是构成肺表面活性物质进化最早、不可或缺的疏水性蛋白之一。其主要功能是促进磷脂分子扩散,增加单分子膜的稳定性,提高脂质-蛋白复合物的表面活性,具有调节肺泡气液界面表面张力的功能。急性肺损伤(ALI)过程中炎症因子会导致肺泡Ⅱ型上皮细胞形态、功能发生变化,表面活性物质合成减少;而SP-B合成的减少、构像的改变及活性的降低,会进一步加重ALI的病理过程。重组瑞替普酶(r-PA)是第三代溶栓药物,能有效清除心、肺等部位血管中出现的凝血块,r-PA与SP-B的融合蛋白能为ALI替补治疗开发一个新型的基因工程药物。研究目的:本课题研究目的在于构建、表达r-PA与SP-B的融合蛋白,通过摸索SP-B融合表达的特性,使其既具有r-PA清除凝血块的作用,又具有SP-B表面活性功能的特点,为ALI替补治疗开发新型的基因工程药物。研究方法:(1)研究SP-B融合表达的特性。SP-B难以用常规氨基酸合成方法获得,先通过合成成熟SP-B的基因,构建在质粒pGEX4T-1上,将GST-tag与SP-B融合,后用IPTG诱导表达,利用Western Blot检测...

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
1 引言
    1.1 肺表面活性物质的组成
    1.2 肺表面活性蛋白B的结构与功能
    1.3 肺表面活性蛋白B的生物物理活性
    1.4 急性肺损伤与肺表面活性蛋白B
    1.5 瑞替普酶
    1.6 研究目的及意义
    1.7 研究内容及技术路线
2 肺表面活性蛋白B的融合表达特性研究
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 SP-B基因合成与引物设计
        2.2.2 SP-B的PCR扩增
        2.2.3 pGEX4T-1/SP-B表达载体的构建
        2.2.4 IPTG诱导SP-B表达
        2.2.5 Western Blot检测SP-B的表达
        2.2.6 GST/SP-B蛋白的纯化
    2.3 结果与分析
        2.3.1 稀有密码子的优化
        2.3.2 GST/SP-B融合表达载体的构建
        2.3.3 重组蛋白的表达与分析
        2.3.4 Western Blot结果分析
        2.3.5 重组蛋白的纯化结果
    2.4 结论与讨论
3 r-PA/SP-B融合表达载体构建
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 主要试剂
        3.1.2 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 设计依据
        3.2.2 r-PA基因序列与SP-B基因来源
        3.2.3 融合表达质粒的构建
        3.2.4 融合表达质粒的鉴定
    3.3 结果与分析
        3.3.1 融合表达质粒构建结果
        3.3.2 融合表达质粒鉴定结果
        3.3.3 融合表达质粒测序结果
        3.3.4 融合表达质粒Western Blot检测结果
    3.4 结论与讨论
4 r-PA/SP-B的细胞荧光定位
    4.1 材料与仪器
        4.1.1 主要试剂材料
        4.1.2 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 细胞培养
        4.2.2 瞬时转染和转染效率
        4.2.3 r-PA与r-PA/SP-B的细胞荧光定位
    4.3 结果与分析
        4.3.1 细胞培养结果
        4.3.2 脂质体转染细胞毒性分析结果
        4.3.3 pEZ-M03质粒在CCL149细胞中的荧光定位
        4.3.4 r-PA细胞荧光定位结果
        4.3.5 r-PA/SP-B细胞荧光定位结果
    4.4 结论与讨论
5 基于ALI的r-PA/SP-B功能研究
    5.1 材料与仪器
        5.1.1 主要试剂材料
        5.1.2 主要仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 细胞培养与脂质体转染
        5.2.2 细胞损伤模型的构建
        5.2.3 细胞拉曼光谱扫描
        5.2.4 r-PA/SP-B纤溶酶活性的测定
    5.3 结果与分析
        5.3.1 细胞损伤模型构建结果
        5.3.2 CCL149细胞损伤模型融合蛋白的定位
        5.3.3 细胞拉曼光谱扫描结果
        5.3.4 r-PA/SP-B纤溶酶活性测定结果
    5.4 结论与讨论
6 总结与展望
    6.1 总结
    6.2 展望
致谢
参考文献
附录



本文编号：3828493