断裂内含肽C片段在大肠埃希菌表达系统中酶解稳定性的改良

发布时间：2023-07-27 07:21

　　断裂内含肽Npu DnaE介导的蛋白质剪接、剪切反应,可以应用于蛋白质工程领域诸多方面,但其C段重组蛋白在表达纯化过程中发生的降解,降低了重组蛋白的产率和纯度。为提高NpuC段稳定性,本研究构建了N端融合NpuN2片段的NpuC延长变体N2C。将N2C在BL21(DE3)中进行表达、用亲和色谱进行纯化,用ImageJ扫描计算表达纯化中降解情况,进而对影响内含肽C端剪切反应的各因素如温度、DTT浓度、N/C比例等进行了考察。结果表明,延长变体N2C使降解产物占比降低至2. 7%～7. 2%,在1 mmol/L DTT催化,N/C比例为5∶1,37℃反应条件下,30 min产物生成率达90%。N2C在提升Npu DnaE内含肽C段在大肠埃希菌表达系统中表达、纯化过程的稳定性的同时,保留了其C端剪切反应的活性,对其在蛋白纯化领域应用有重要意义。

【文章页数】：9 页

【文章目录】：
1 材料
    1.1 试剂
    1.2 仪器
    1.3 菌株和质粒
2 方法
    2.1 重组表达质粒的构建
    2.2 重组蛋白的诱导表达及纯化
        2.2.1 重组蛋白的诱导表达
        2.2.2 重组蛋白的亲和纯化
    2.3 N2C的C端剪切反应
        2.3.1 Western blot和SDS-PAGE检测N2C的C端剪切反应
        2.3.2 影响N2C的C端剪切反应因素
3 结果
    3.1 重组表达质粒的构建
    3.2 Npu C段重组蛋白在表达纯化过程中的降解情况
    3.3 N2C的C端剪切反应
        3.3.1 Western blot检测N2C的C端剪切反应
        3.3.2 SDS-PAGE检测N2C的C端剪切反应
        3.3.3 影响N2C的C端剪切反应的因素
4 讨论



本文编号：3837583