基因/化疗药物共输送的环境响应性PLGA超声纳米泡协同抗肿瘤作用及其超声成像研究

发布时间：2024-01-27 05:14

　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,目前乳腺癌的发病率逐年上升,极大地威胁了女性的身体健康。因此,癌症的早期诊断和治疗显得尤为关键。一方面,超声成像是早期成像的主要分子成像技术,而超声微泡造影剂,如PLGA纳米泡,不仅可以提高图像对比度,还具有较好的生物安全性;另一方面,化疗仍然是治疗癌症的主要方式,常用的化疗药物如DOX能一定程度地抑制肿瘤的生长。但是,乳腺癌对化疗药物的多药耐药性极大地限制了药物的使用,通过RNAi手段可以通过阻止化疗药物的泄露来克服多药耐药性,实现对肿瘤的基因治疗。肿瘤细胞的微环境与正常细胞存在差异,如:肿瘤组织的pH值维持在5.0-5.5之间,而正常组织的pH一般保持在7.35-7.45之间。PAH-Cit是一类电荷翻转共聚物,在酸性环境下酰胺键极易水解。基于以上理由,本文构建了一种具有pH响应的PLGA纳米泡,共载DOX和P-gp shRNA实现超声成像和药物、基因协同治疗。首先,我们合成了Dox-PLGA,通过SEM、DLS、UV等方式证实成功地合成了粒径约300nm左右的Dox-PLGA纳米泡。然后,通过1HNMR和FTIR验证了PAH-Cit聚合物的成功合...

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 分子成像技术
        1.1.1 超声成像
        1.1.2 磁共振成像
        1.1.3 CT成像
        1.1.4 荧光成像
    1.2 纳米药物载体概述
        1.2.1 纳米药物载体的分类
            1.2.1.1 无机纳米粒子
            1.2.1.2 纳米脂质体
            1.2.1.3 高分子聚合物材料
        1.2.2 纳米药物载体的性质
    1.3 肿瘤的多药耐药性
        1.3.1 肿瘤的多药耐药性及产生原因
        1.3.2 常用克服多药耐药性的策略
    1.4 环境响应型纳米药物载体
        1.4.1 温度响应型
        1.4.2 PH响应型
        1.4.3 氧化还原响应型
        1.4.4 光响应型
    1.5 课题的提出与主要研究内容
        1.5.1 论文选题依据与意义
        1.5.2 本课题的主要研究内容
第二章 DOX-PLGA/PEI/PAH-CIT/PEI/P-GP SHRNA的合成与表征
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验试剂
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 溶液配置
    2.3 实验方法
        2.3.1 PLGA NBS和DOX-PLGA NBS的制备
        2.3.2 PLGA NBS和DOX-PLGA NBS的表征
            2.3.2.1 扫描电镜观察纳米泡的形貌
            2.3.2.2 紫外分光光度计测定DOX的吸收峰
            2.3.2.3 包封率和载药率的测定
        2.3.3 DOX-PLGA/PEI NBS的制备
        2.3.4 DOX-PLGA/PEI NBS的表征
            2.3.4.1 纳米泡粒径分析
            2.3.4.2 纳米泡ZETA电位分析
        2.3.5 PAH-CIT的制备
        2.3.6 PAH-CIT的表征
        2.3.7 DOX-PLGA/PEI/PAH-CIT/PEI的制备
        2.3.8 DOX-PLGA/PEI/PAH-CIT/PEI/P-GP SHRNA的制备
        2.3.9 琼脂糖凝胶电泳实验
        2.3.10 P-GP SHRNA质粒的提取(OMEGA质粒提取说明书)
        2.3.11 基因体外释放实验
        2.3.12 体外超声成像实验
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 PLGA NBS和DOX-PLGA NBS的形貌分析
        2.4.2 包封率和载药率的测定
        2.4.3 纳米泡粒径及ZETA电位分析
        2.4.4 PAH-CIT的表征
        2.4.5 纳米泡形貌分析
        2.4.6 纳米泡粒径分析
        2.4.7 纳米泡ZETA电位分析
        2.4.8 琼脂糖凝胶电泳实验
        2.4.9 体外超声成像实验
    2.5 小结
第三章 DOX-PLGA/PEI/PAH-CIT/PEI/P-GP SHRNA体外治疗效果
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 细胞系
        3.2.2 实验试剂
        3.2.3 实验仪器
        3.2.4 溶液配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 HELA、HUVEC、MCF-7、MCF-7/ADR细胞复苏
        3.3.2 细胞传代
        3.3.3 细胞冻存
        3.3.4 细胞毒性实验
        3.3.5 共聚焦显微镜观察细胞内吞情况
        3.3.6 流式细胞术检测细胞内吞情况
        3.3.7 定量PCR实验
            3.3.7.1 细胞总RNA提取
            3.3.7.2 逆转录反应
            3.3.7.3 PCR扩增反应
        3.3.8 免疫印迹实验
            3.3.8.1 收集蛋白样品
            3.3.8.2 SDS-PAGE凝胶电泳
            3.3.8.3 转膜
            3.3.8.4 免疫反应
            3.3.8.5 化学发光、显影、定影
        3.3.9 CALCEIN-AM/PI双染实验
        3.3.10 细胞周期实验
    3.4 实验结果与讨论
        3.4.1 细胞毒性实验
        3.4.2 共聚焦显微镜观察细胞内吞情况
        3.4.3 流式细胞术检测细胞内吞情况
        3.4.4 定量PCR实验
        3.4.5 免疫印迹实验
        3.4.6 协同治疗效果
        3.4.7 CALCEIN-AM/PI双染实验
        3.4.8 细胞周期实验
    3.5 小结
第四章 DOX-PLGA/PEI/PAH-CIT/PEI/P-GP SHRNA活体成像及抗肿瘤效果
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验动物及细胞株
        4.2.2 实验试剂
        4.2.3 实验仪器
        4.2.4 溶液配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 肿瘤模型的建立
        4.3.2 体内超声成像
        4.3.3 体内协同抗肿瘤作用
        4.3.4 组织病理学分析
            4.3.4.1 HE染色
            4.3.4.2 TUNEL染色
        4.3.5 血液学分析及血液生化检测
    4.4 实验结果与讨论
        4.4.1 体内超声成像
        4.4.2 体内毒副作用
        4.4.3 血液学分析
        4.4.4 体内协同抗肿瘤作用
    4.5 小结
第五章 全文总结
致谢
参考文献
硕期间取得的研究成果



本文编号：3886368