基于HIV-1 MPER的抗菌肽设计及抗菌机理研究

发布时间：2017-05-23 19:04

  本文关键词：基于HIV-1 MPER的抗菌肽设计及抗菌机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,由于传统抗生素的广泛应用,导致耐药菌株的出现,这给人类的健康带来极大的威胁,使得研制一种新型的具有广谱抗菌活性的抗菌药物来替代传统的抗生素,成为一项迫切的任务。抗菌肽是生物体先天性免疫应答的重要组成部分,在生物体抵御外来病原微生物入侵时发挥着重要的作用。与传统的抗生素相比,抗菌肽具有广谱的抗菌活性、分子量小、细胞毒性低、热稳定性好及不易产生耐药性等优点。据文献报道,HIV-1的胞外近膜区域(MPER:Ac-665WASLWNWFNITNW LWYIK683-NH2)具有膜扰乱的活性,而一种来源于牛嗜中性粒细胞的天然抗菌肽Indolicidin和MPER类似,也具有膜扰乱的活性并且含有较高比例的色氨酸。基于此,我们认为有膜扰乱活性的HIV-1MPER或其上的某一肽段也可能具有潜在的抗菌活性。在抗菌肽序列筛选过程中,基于分子量因素、中和抗体4E10识别表位因素及高比例色氨酸含量导致红细胞溶血因素,我们选择HIV-1 MPER上的4E10中和抗体识别表位(NWFNITNWLWYIK)用于抗菌肽研究实验。虽然抗菌肽的氨基酸序列组成多种多样,但是某些特定的氨基酸,比如赖氨酸和精氨酸是抗菌肽的重要组成部分,并且富含赖氨酸的抗菌肽更易表现出快速的、广谱的抗菌活性,而且不易产生溶血活性。为了使设计的抗菌肽具有这一特性,我们在4E10表位的C-末端添加了三个赖氨酸残基(NWFNITNWLWYIKKKK),以增加多肽的正电性和水溶性,并将其命名为AP16。在AP16抗菌活性研究中,通过对革兰氏阴性菌株大肠杆菌(E.coli DH5α)、革兰氏阳性菌株枯草杆菌(B.subtilis ATCC 6633)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis ATCC 12228)最小杀菌浓度(MBC)的检测,我们确定了AP16对表皮葡萄球菌[MBC:256μg/m L(115.07μM)]有抗菌活性,及对枯草杆菌[MBC:32μg/mL(14.38μM)]的抗菌活性较好,而AP16对大肠杆菌没有明显的抗菌活性。基于获得的AP16初步抗菌活性结果,我们通过氨基酸突变或增加序列中碱性氨基酸的数目来增强AP16的抗菌活性。与AP16相比,其衍生抗菌肽AP16-A对大肠杆菌的MBC值为16μg/mL(7.34μM),对枯草杆菌的MBC值[4μg/mL(1.834μM)]提高了8倍,对表皮葡萄球菌的MBC值[8μg/mL(3.67μM)]提高了32倍。通过体内和体外的抗菌肽细胞毒性检测,AP16-A对哺乳动物细胞和红细胞没有明显的细胞毒性。在多肽稳定性检测中,AP16-A在37℃下的稳定好,经过15天的热处理后,仍有抗菌活性,并且最小杀菌浓度没有改变。通过NPN吸收实验和脂多糖(LPS)结合实验,我们提出并验证了抗菌肽AP16-A能够与LPS相互作用并透化革兰氏阴性菌外膜的抗菌机理。并通过杀菌动力学实验、激光共聚焦显微镜观察、SYTOX Green吸收实验和凝胶阻滞实验,证明AP16-A对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌抗菌机理的不同,即AP16-A能够快速的透化革兰氏阳性菌细胞膜并产生较快的杀菌动力学,而透化革兰氏阴性菌细胞膜速度较慢并与胞内的物质相互作用,从而产生相对较慢的杀菌动力学。综上所述,本研究筛选并合成具有良好抗菌活性的抗菌肽AP16-A及验证其潜在的抗菌机理。AP16-A可以作为一种抗菌肽用于进一步的研究。
【关键词】：抗菌肽 抗菌活性 杀菌动力学 透化细胞膜 DNA结合 LPS结合
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R91;R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词表8-13
• 第一章 绪论13-28
• 1.1 抗菌肽概述13
• 1.2 抗菌肽的生物活性13-16
• 1.2.1 抗细菌活性13-14
• 1.2.2 抗真菌活性14
• 1.2.3 抗寄生虫活性14-15
• 1.2.4 抗病毒活性15
• 1.2.5 抗癌细胞活性15
• 1.2.6 免疫调节活性15-16
• 1.3 抗菌肽的来源16
• 1.4 抗菌肽的分类16-18
• 1.4.1 α-螺旋结构抗菌肽16-17
• 1.4.2 β-折叠结构抗菌肽17
• 1.4.3 无规则结构抗菌肽17
• 1.4.4 环状结构抗菌肽17-18
• 1.5 抗菌肽序列中特殊氨基酸残基的结构性质18-20
• 1.5.1 赖氨酸（Lys，K）和精氨酸（Arg，，R）18-19
• 1.5.2 色氨酸（Trp,W）19
• 1.5.3 半胱氨酸（Cys,C）和二硫键19-20
• 1.5.4 脯氨酸（Pro,P）20
• 1.6 抗菌肽的作用机制20-25
• 1.6.1 抗菌肽的细胞选择性20-21
• 1.6.2 抗菌肽对细菌的作用机制21-25
• 1.7 HIV的胞外近膜区域（MPER）25-26
• 1.8 立题依据和实验设计26-28
• 第二章 实验材料与方法28-41
• 2.1 实验材料28-32
• 2.1.1 多肽合成28
• 2.1.2 质粒、细胞和细菌28-29
• 2.1.3 主要试剂和材料29-30
• 2.1.4 主要仪器30
• 2.1.5 实验动物30
• 2.1.6 试剂配制30-32
• 2.2 实验方法32-41
• 2.2.1 多肽配制32
• 2.2.2 多肽的最小杀菌浓度检测32-33
• 2.2.3 AP16-A的质量表征33
• 2.2.4 AP16-A和蜂毒肽的抗菌活性比较33-34
• 2.2.5 毒性检测34-36
• 2.2.6 37℃条件下AP16-A的稳定性检测36
• 2.2.7 AP16-A的杀菌动力学36-37
• 2.2.8 AP16-A杀菌机理37-41
• 第三章 实验结果与讨论41-57
• 3.1 以HIV-1 MPER为基础的抗菌肽的设计41-42
• 3.2 以AP16为基础的分子改造42-43
• 3.3 AP16-A的质量检测43-44
• 3.4 AP16-A和天然抗菌肽Melittin的抗菌活性比较44-46
• 3.5 AP16-A的细胞毒性研究46-48
• 3.5.1 AP16-A对hCMEC/D3的细胞毒性46
• 3.5.2 AP16-A的溶血活性46-47
• 3.5.3 在小鼠体内的AP16-A的细胞毒性47-48
• 3.6 AP16-A的热稳定性检测48-50
• 3.7 AP16-A在 1×MBC浓度下的杀菌动力学50-51
• 3.8 AP16-A的杀菌机理研究51-57
• 3.8.1 AP16-A透化革兰氏阴性菌的细胞外膜51-52
• 3.8.2 AP16-A能够与革兰氏阴性菌外膜上的LPS结合52
• 3.8.3 AP16-A作用于菌株的具体位置的确定52-53
• 3.8.4 AP16-A透化细菌的细胞膜53-55
• 3.8.5 AP16-A与胞内物质（DNA）相互作用55-57
• 结论57-58
• 参考文献58-69
• 作者简介69-70
• 致谢70

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1 贺晓秋;基于HIV-1 MPER的抗菌肽设计及抗菌机理研究[D];吉林大学;2016年

  本文关键词：基于HIV-1 MPER的抗菌肽设计及抗菌机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：388817